引言
百合（Lilium spp.）是重要的观赏花卉和经济作物，其组织培养技术在种苗快速繁殖、脱毒复壮、遗传转化和种质资源保存等方面具有重要意义。与传统繁殖方式相比，组织培养具有繁殖系数高、不受季节限制、可保持品种特性等优势。本文将系统介绍百合组织培养的全流程操作，从外植体选择、消毒、诱导、继代、生根到再生植株的移栽，为科研人员和生产者提供详细的操作指南。
一、实验准备
1.1 实验材料与设备
主要材料：
- 百合鳞茎、叶片、花器官等外植体
- 培养基成分：MS培养基基础成分（Murashige & Skoog, 1962）、植物激素（6-BA、NAA、IAA、2,4-D等）、蔗糖、琼脂、活性炭等
- 消毒剂：70%乙醇、次氯酸钠（NaClO）、吐温-20等
- 无菌水、蒸馏水
主要设备：
- 超净工作台
- 高压灭菌锅
- 培养室（温度25±2℃，光照16h/d，光照强度2000-3000 lux）
- 分析天平、pH计
- 培养瓶、培养皿、移液器等
1.2 培养基配制
MS培养基基础配方（1L）：
大量元素：
NH₄NO₃ 1650 mg
KNO₃ 1900 mg
CaCl₂·2H₂O 440 mg
MgSO₄·7H₂O 370 mg
KH₂PO₄ 170 mg
微量元素：
MnSO₄·4H₂O 22.3 mg
ZnSO₄·7H₂O 8.6 mg
H₃BO₃ 6.2 mg
KI 0.83 mg
Na₂MoO₄·2H₂O 0.25 mg
CuSO₄·5H₂O 0.025 mg
CoCl₂·6H₂O 0.025 mg
铁盐：
FeSO₄·7H₂O 27.8 mg
Na₂-EDTA 37.3 mg
有机物：
肌醇 100 mg
烟酸 0.5 mg
盐酸硫胺素 0.1 mg
盐酸吡哆醇 0.5 mg
甘氨酸 2.0 mg
碳源：
蔗糖 30 g
固化剂：
琼脂 7-8 g
激素配制：
- 6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）：母液浓度1 mg/mL，用0.1M NaOH溶解
- NAA（α-萘乙酸）：母液浓度1 mg/mL，用少量95%乙醇溶解后加水
- IAA（吲哚乙酸）：母液浓度1 mg/mL，用少量95%乙醇溶解后加水
- 2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）：母液浓度1 mg/mL，用0.1M NaOH溶解
培养基配制步骤：
- 按配方称取各成分，先溶解大量元素和微量元素
- 加入铁盐、有机物和激素母液
- 定容至1L，调节pH至5.8
- 加入琼脂，加热溶解
- 分装至培养瓶，121℃高压灭菌15分钟
二、外植体选择与消毒
2.1 外植体类型选择
不同外植体的特点：
- 鳞茎片：最常用，易消毒，再生能力强
- 叶片：取材方便，但易污染
- 花器官：花蕾、花瓣等，再生率较低
- 茎尖：脱毒效果好，但取材困难
最佳外植体选择：
- 鳞茎片：选择健康、无病虫害的百合鳞茎，剥去外层褐色鳞片，取内部白色鳞片
- 叶片：选择幼嫩、展开的叶片
- 花蕾：选择未开放的花蕾，直径约1-2cm
2.2 外植体消毒流程
以鳞茎片为例的详细消毒步骤：
步骤1：预处理
1. 将新鲜百合鳞茎在4℃冰箱中冷藏2-3天，打破休眠
2. 用自来水冲洗30分钟，去除表面污垢
3. 在超净工作台中，用70%乙醇浸泡30秒
4. 用无菌水冲洗2-3次
步骤2：消毒处理
1. 配制消毒液：2%次氯酸钠溶液（含0.1%吐温-20）
2. 将外植体浸泡在消毒液中8-12分钟（根据外植体大小调整）
3. 期间轻轻摇晃，确保消毒液接触所有表面
4. 用无菌水冲洗5-6次，每次2-3分钟，彻底去除消毒剂残留
步骤3：切割与接种
1. 将消毒后的鳞茎片切成0.5×0.5cm的小块
2. 注意避开鳞片基部的生长点
3. 将小块接种到诱导培养基上，每瓶接种4-6块
4. 标记接种日期、外植体类型、培养基配方
不同外植体消毒时间参考：
| 外植体类型 | 70%乙醇(s) | 次氯酸钠(min) | 污染率(%) | 成活率(%) |
|---|---|---|---|---|
| 鳞茎片 | 30 | 8-10 | 5-10 | 85-95 |
| 叶片 | 20 | 6-8 | 15-25 | 70-85 |
| 花蕾 | 30 | 10-12 | 10-15 | 60-75 |
| 茎尖 | 15 | 3-5 | 2-5 | 90-95 |
注意事项：
- 消毒时间需根据外植体成熟度、污染程度调整
- 次氯酸钠浓度不宜超过3%，否则易造成组织损伤
- 消毒后若发现污染，立即隔离处理
三、愈伤组织诱导与分化
3.1 愈伤组织诱导
诱导培养基配方：
MS + 6-BA 1.0-2.0 mg/L + NAA 0.5-1.0 mg/L + 蔗糖30g/L + 琼脂7g/L
pH 5.8
操作流程：
- 将消毒后的外植体接种到诱导培养基
- 培养条件：25±2℃，暗培养或弱光（500-1000 lux）
- 观察记录：每3天观察一次，记录愈伤组织形成情况
不同激素配比对愈伤组织诱导的影响：
| 6-BA (mg/L) | NAA (mg/L) | 愈伤组织诱导率(%) | 愈伤组织状态 |
|---|---|---|---|
| 0.5 | 0.2 | 45 | 疏松、淡黄色 |
| 1.0 | 0.5 | 78 | 致密、淡绿色 |
| 2.0 | 1.0 | 85 | 致密、绿色 |
| 3.0 | 1.5 | 72 | 玻璃化、易褐变 |
愈伤组织诱导时间：
- 鳞茎片：15-20天开始形成愈伤组织
- 叶片：20-25天
- 花器官：25-30天
常见问题及解决：
- 外植体褐变：添加活性炭（0.1-0.3%）或抗氧化剂（VC 50mg/L）
- 污染：严格消毒，控制接种密度
- 不形成愈伤组织：调整激素配比，延长培养时间
3.2 愈伤组织分化
分化培养基配方：
MS + 6-BA 1.5-2.5 mg/L + NAA 0.1-0.3 mg/L + 蔗糖30g/L + 琼脂7g/L
pH 5.8
操作流程：
- 将诱导产生的愈伤组织切割成0.3-0.5cm³的小块
- 接种到分化培养基，每瓶接种4-6块
- 培养条件：25±2℃，光照16h/d，光照强度2000-3000 lux
- 观察记录：每5天观察一次，记录芽分化情况
分化时间：
- 优质愈伤组织：15-20天开始分化
- 一般愈伤组织：25-30天
- 老化愈伤组织：30-40天
提高分化率的技巧：
- 愈伤组织选择：选择致密、绿色、生长旺盛的愈伤组织
- 激素调整：6-BA/NAA比值在5:1至10:1之间
- 光照调节：分化初期弱光，后期增强光照
- 继代培养：将愈伤组织继代1-2次后再分化
不同外植体的分化能力：
| 外植体类型 | 愈伤组织诱导率 | 分化率 | 平均芽数/愈伤组织 |
|---|---|---|---|
| 鳞茎片 | 85% | 75% | 3-5 |
| 叶片 | 70% | 60% | 2-4 |
| 花器官 | 65% | 45% | 1-3 |
| 茎尖 | 90% | 85% | 5-8 |
四、继代培养与扩繁
4.1 继代培养的目的
- 扩大繁殖系数：通过多次继代获得大量材料
- 保持材料活力：防止愈伤组织老化
- 筛选优质材料：选择生长旺盛、分化能力强的愈伤组织
4.2 继代培养操作
继代培养基配方：
MS + 6-BA 1.0-1.5 mg/L + NAA 0.2-0.5 mg/L + 蔗糖30g/L + 琼脂7g/L
pH 5.8
操作步骤：
1. 准备超净工作台，消毒工具（镊子、解剖刀）
2. 选择生长旺盛的愈伤组织或丛生芽
3. 切割成0.3-0.5cm³的小块
4. 接种到新鲜培养基，每瓶接种4-6块
5. 标记继代次数、日期
6. 培养条件：25±2℃，光照16h/d
继代周期：
- 愈伤组织：20-25天继代一次
- 丛生芽：15-20天继代一次
- 单芽：25-30天继代一次
继代次数对材料的影响：
| 继代次数 | 繁殖系数 | 材料状态 | 建议 |
|---|---|---|---|
| 1-3次 | 5-8 | 生长旺盛 | 适合扩繁 |
| 4-6次 | 8-12 | 稳定生长 | 适合保存 |
| 7-10次 | 10-15 | 可能老化 | 需筛选 |
| >10次 | 不稳定 | 易玻璃化 | 需复壮 |
继代培养常见问题：
- 玻璃化现象：降低激素浓度，增加琼脂浓度至8-9g/L
- 生长缓慢：更换新鲜培养基，调整激素配比
- 褐变：添加活性炭（0.1-0.3%），缩短继代周期
4.3 繁殖系数计算
繁殖系数 = （继代后总芽数）/（继代前芽数）
示例计算：
初始材料：1个愈伤组织块
继代后：获得8个愈伤组织块
繁殖系数 = 8/1 = 8
经过3次继代：
第1次：繁殖系数8
第2次：繁殖系数8
第3次：繁殖系数8
总繁殖系数 = 8×8×8 = 512
五、生根培养
5.1 生根培养基配方
生根培养基：
1/2 MS + IAA 0.5-1.0 mg/L + NAA 0.2-0.5 mg/L + 蔗糖20g/L + 琼脂7g/L
活性炭 0.1-0.3%
pH 5.8
不同激素组合对生根的影响：
| IAA (mg/L) | NAA (mg/L) | 生根率(%) | 平均根数/株 | 根长(cm) |
|---|---|---|---|---|
| 0.5 | 0.2 | 75 | 3-5 | 2-3 |
| 0.8 | 0.3 | 85 | 5-8 | 3-4 |
| 1.0 | 0.5 | 90 | 6-10 | 4-5 |
| 1.5 | 0.8 | 82 | 8-12 | 2-3 |
5.2 生根操作流程
步骤1：材料准备
- 选择生长健壮、高度2-3cm的无根苗
- 切去基部愈伤组织，保留茎基部0.5cm
- 用无菌水冲洗1-2次
步骤2：接种
1. 将无根苗接种到生根培养基
2. 每瓶接种4-6株
3. 培养条件：25±2℃，光照16h/d，光照强度2000-3000 lux
4. 培养时间：15-25天
步骤3：观察记录
- 第5天：开始形成白色根原基
- 第10天：可见明显根系
- 第15-20天：根系发达，可移栽
生根培养注意事项：
- 活性炭的作用：吸附有害物质，促进生根，但过量会抑制生长
- 光照调节：生根初期可适当降低光照强度
- 温度控制：保持稳定，避免波动
六、再生植株移栽
6.1 移栽前准备
炼苗：
- 将生根苗连瓶移至培养室自然光下炼苗3-5天
- 逐步打开瓶盖，适应外界环境
- 炼苗期间保持瓶内湿度
基质准备：
基质配方：
- 草炭:珍珠岩:蛭石 = 3:1:1
- 或 草炭:河沙 = 2:1
- 基质需消毒：121℃高压灭菌30分钟，或暴晒消毒
移栽容器：
- 育苗盘：穴盘或平盘
- 花盆：直径8-10cm的塑料盆
- 保持容器清洁，底部有排水孔
6.2 移栽操作
步骤1：取苗
1. 用镊子轻轻取出再生植株
2. 用温水（25℃）冲洗根部，去除培养基
3. 修剪过长根系，保留3-5cm
4. 用多菌灵溶液（500倍）浸泡5分钟消毒
步骤2：移栽
1. 在育苗盘中装入消毒基质
2. 用细棍在基质中打孔
3. 将植株放入孔中，根系舒展
4. 轻轻压实基质，使植株稳固
5. 浇透水（含1/4 MS营养液）
步骤3：移栽后管理
1. 环境控制：
- 温度：20-25℃
- 湿度：80-90%（用塑料薄膜覆盖保湿）
- 光照：5000-10000 lux，避免直射光
2. 水分管理：
- 第1周：保持基质湿润，每天喷雾1-2次
- 第2周：逐渐减少喷雾，正常浇水
- 第3周后：正常管理
3. 肥料管理：
- 第1个月：1/4 MS营养液，每周1次
- 第2个月：1/2 MS营养液，每周1次
- 第3个月：全量MS营养液，每2周1次
6.3 移栽成活率影响因素
| 因素 | 理想条件 | 对成活率的影响 |
|---|---|---|
| 基质 | 疏松透气、保水性好 | 成活率提高20-30% |
| 湿度 | 80-90% | 成活率提高15-25% |
| 温度 | 20-25℃ | 成活率提高10-20% |
| 光照 | 5000-10000 lux | 成活率提高10-15% |
| 根系质量 | 根系发达、无损伤 | 成活率提高20-35% |
移栽后常见问题及解决：
- 萎蔫：增加湿度，减少光照
- 烂根：控制浇水，改善基质透气性
- 生长缓慢：补充营养液，调整光照
- 病虫害：及时喷洒杀菌剂、杀虫剂
七、实验记录与数据分析
7.1 实验记录表
外植体消毒记录表：
| 日期 | 外植体类型 | 消毒时间 | 污染率 | 成活率 | 备注 |
|---|---|---|---|---|---|
诱导分化记录表：
| 日期 | 培养基配方 | 愈伤组织诱导率 | 分化率 | 平均芽数 | 备注 |
|---|---|---|---|---|---|
生根移栽记录表：
| 日期 | 生根率 | 平均根数 | 根长 | 移栽成活率 | 备注 |
|---|---|---|---|---|---|
7.2 数据分析方法
统计方法：
- 方差分析（ANOVA）：比较不同处理间的差异
- 多重比较：如Tukey HSD检验
- 回归分析：分析激素浓度与响应的关系
示例分析：
假设我们比较三种激素配比对愈伤组织诱导率的影响：
处理A：6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.5 mg/L，诱导率78%
处理B：6-BA 1.5 mg/L + NAA 0.3 mg/L，诱导率85%
处理C：6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L，诱导率72%
通过方差分析，若p<0.05，则处理间差异显著。
进一步多重比较，确定最优处理。
八、常见问题与解决方案
8.1 污染问题
污染类型及原因：
细菌污染：培养基浑浊，有菌落
- 原因：消毒不彻底，操作不规范
- 解决：加强消毒，规范操作
真菌污染：白色、黑色菌丝
- 原因：空气污染，培养基污染
- 解决：净化空气，严格消毒
内生菌污染：外植体内部污染
- 原因：外植体本身带菌
- 解决：选择健康材料，延长消毒时间
预防措施：
- 严格无菌操作
- 定期清洁超净工作台
- 使用新鲜消毒剂
- 控制接种密度
8.2 褐变问题
褐变原因：
- 外植体受伤，酚类物质氧化
- 培养基中激素浓度过高
- 培养温度过高
解决方法：
- 预处理：外植体预冷处理，添加抗氧化剂
- 培养基调整：添加活性炭（0.1-0.3%），降低激素浓度
- 培养条件：降低温度至20-22℃，暗培养初期
8.3 玻璃化问题
玻璃化特征： 植株矮小、叶片透明、茎节缩短
原因：
- 激素浓度过高
- 琼脂浓度不足
- 湿度过高
- 光照不足
解决方法：
- 降低激素浓度，特别是6-BA
- 增加琼脂浓度至8-9g/L
- 降低培养瓶湿度（减少培养基水分）
- 增加光照强度
8.4 分化率低
可能原因：
- 愈伤组织老化
- 激素配比不当
- 培养条件不适宜
解决方法：
- 选择新鲜、致密的愈伤组织
- 调整6-BA/NAA比值至5:1-10:1
- 优化光照和温度条件
九、实验优化与进阶技术
9.1 培养基优化
正交试验设计：
因素：6-BA、NAA、蔗糖浓度
水平：各3个水平
设计：L9(3^4)正交表
指标：愈伤组织诱导率、分化率
示例正交试验：
| 试验号 | 6-BA (mg/L) | NAA (mg/L) | 蔗糖 (g/L) | 诱导率(%) | 分化率(%) |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 1.0 | 0.5 | 20 | 72 | 65 |
| 2 | 1.0 | 1.0 | 30 | 78 | 70 |
| 3 | 1.0 | 1.5 | 40 | 68 | 60 |
| 4 | 2.0 | 0.5 | 30 | 85 | 75 |
| 5 | 2.0 | 1.0 | 40 | 82 | 72 |
| 6 | 2.0 | 1.5 | 20 | 75 | 68 |
| 7 | 3.0 | 0.5 | 40 | 70 | 62 |
| 8 | 3.0 | 1.0 | 20 | 65 | 58 |
| 9 | 3.0 | 1.5 | 30 | 60 | 55 |
数据分析： 通过极差分析，确定各因素的主次关系和最优组合。
9.2 体细胞胚胎发生
体细胞胚胎发生培养基：
MS + 2,4-D 1.0-2.0 mg/L + 6-BA 0.5-1.0 mg/L + 蔗糖30g/L + 琼脂7g/L
操作流程：
- 诱导胚性愈伤组织
- 转入无激素或低激素培养基
- 体细胞胚发育
- 成熟和萌发
优点： 繁殖系数高，遗传稳定性好
9.3 原生质体培养
原生质体分离：
酶解液：纤维素酶2% + 离析酶1% + 甘露醇0.5M + MES缓冲液
条件：25℃，暗培养2-4小时
培养方法：
- 固体培养：琼脂糖包埋
- 液体培养：浅层培养
- 悬滴培养
应用： 体细胞杂交、遗传转化
十、百合组织培养的应用
10.1 快速繁殖
繁殖效率对比：
| 繁殖方式 | 年繁殖倍数 | 成本 | 技术要求 |
|---|---|---|---|
| 分球繁殖 | 3-5倍 | 低 | 低 |
| 扦插繁殖 | 5-10倍 | 中 | 中 |
| 组织培养 | 100-1000倍 | 高 | 高 |
商业化生产流程：
原种 → 鳞茎片消毒 → 诱导培养 → 继代扩繁 → 生根培养 → 移栽 → 商品苗
10.2 脱毒复壮
茎尖培养脱毒：
- 取0.2-0.5mm茎尖
- 消毒后接种
- 培养获得无毒苗
- 病毒检测（ELISA、RT-PCR）
脱毒效果：
- 百合无症病毒（LSV）：脱毒率80-90%
- 百合花叶病毒（LMV）：脱毒率70-85%
- 黄瓜花叶病毒（CMV）：脱毒率60-75%
10.3 遗传转化
农杆菌介导法：
1. 预培养：外植体在MS+2,4-D 1.0 mg/L培养2天
2. 农杆菌侵染：OD600=0.5-0.8，侵染10-15分钟
3. 共培养：25℃，暗培养2-3天
4. 筛选培养：添加抗生素（卡那霉素50mg/L，头孢霉素200mg/L）
5. 再生培养：诱导转基因植株
基因枪法：
1. 金粉制备：直径0.6μm金粉，DNA包裹
2. 轰击参数：压力1100psi，距离6cm，真空度25inHg
3. 后培养：暗培养3天，转入筛选培养基
10.4 种质资源保存
超低温保存：
1. 预培养：MS+0.3M蔗糖，25℃培养3天
2. 冷冻保护剂：MS+0.5M甘油+0.5M二甲基亚砜
3. 程序降温：
- 0℃平衡1小时
- 以0.5℃/min降至-40℃
- 液氮保存
4. 解冻：40℃水浴快速解冻
5. 恢复培养：转入正常培养基
保存效果： 存活率70-90%，遗传稳定性好
十一、安全与伦理
11.1 实验室安全
化学品安全：
- 次氯酸钠：腐蚀性，需佩戴手套、护目镜
- 激素：生物活性物质，避免直接接触
- 乙醇：易燃，远离火源
生物安全：
- 无菌操作：防止污染和感染
- 废弃物处理：高压灭菌后丢弃
- 个人防护：实验服、口罩、手套
11.2 生物伦理
遗传资源保护：
- 遵守《生物多样性公约》
- 获取惠益分享
- 保护野生百合资源
基因编辑伦理：
- 遵守相关法律法规
- 评估生态风险
- 公开透明原则
十二、总结
百合组织培养是一项系统工程，涉及多个关键环节。成功的关键在于：
- 外植体选择：健康、幼嫩的材料是成功的基础
- 消毒彻底：平衡消毒效果与组织损伤
- 激素优化：根据品种和外植体类型调整激素配比
- 环境控制：稳定的温度、光照、湿度条件
- 精细操作：无菌操作和规范的实验流程
通过本文的详细指南，读者可以掌握百合组织培养的全流程操作。建议初学者从鳞茎片开始，逐步掌握各环节技术要点。在实际操作中，需根据具体品种和实验条件进行调整，不断优化实验方案。
参考文献：
- Murashige T, Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant. 1962;15(3):473-497.
- 李俊明. 植物组织培养. 北京: 中国农业大学出版社, 2018.
- 王蒂. 植物组织培养. 北京: 中国农业出版社, 2015.
- Steinitz B, et al. Lilium. In: Bajaj YPS, ed. Biotechnology in Agriculture and Forestry. Berlin: Springer, 1997.
- 中国植物学会. 植物组织培养技术规程. 北京: 科学出版社, 2020.
附录：常用培养基配方速查表
| 培养基类型 | 适用阶段 | 6-BA (mg/L) | NAA (mg/L) | IAA (mg/L) | 蔗糖 (g/L) | 琼脂 (g/L) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 诱导培养基 | 愈伤组织 | 1.0-2.0 | 0.5-1.0 | - | 30 | 7 |
| 分化培养基 | 芽分化 | 1.5-2.5 | 0.1-0.3 | - | 30 | 7 |
| 继代培养基 | 扩繁 | 1.0-1.5 | 0.2-0.5 | - | 30 | 7 |
| 生根培养基 | 生根 | - | 0.2-0.5 | 0.5-1.0 | 20 | 7 |
| 保存培养基 | 保存 | 0.5-1.0 | 0.1-0.2 | - | 20 | 8-9 |
注意： 以上配方为通用参考，实际应用需根据百合品种、外植体类型和实验目的进行调整。建议先进行小规模预实验，确定最佳配方。