引言

环境工程微生物学实验是环境科学与工程专业的重要实践课程，它帮助学生掌握微生物在环境治理中的应用，如污水处理、土壤修复和污染物降解等。本指南将详细讲解从培养基制备到菌种鉴定的全流程实操步骤，适用于大学实验室环境。整个过程强调无菌操作、安全规范和数据记录，确保实验的准确性和可重复性。实验中涉及的微生物（如细菌、真菌）可能具有潜在生物危害，因此必须在生物安全柜中操作，并遵守实验室安全规程。

实验材料准备是关键第一步。所需设备包括高压灭菌锅、恒温培养箱、超净工作台、显微镜、pH计等；试剂包括营养琼脂（NA）、牛肉膏蛋白胨培养基成分、革兰氏染色试剂等；耗材包括培养皿、试管、移液枪、无菌水等。所有试剂需使用分析纯级别，并在使用前检查有效期。

第一部分：培养基制备

培养基是微生物生长的基础，其制备需精确控制成分、pH和灭菌条件。环境工程中常用培养基包括营养琼脂（用于一般细菌培养）和选择性培养基（如用于降解污染物的特定菌株）。制备步骤如下：

1.1 成分计算与称量

根据实验需求计算培养基配方。以营养琼脂（NA）为例，标准配方为：牛肉膏 3g、蛋白胨 5g、琼脂 15-20g、蒸馏水 1000mL、pH 7.0-7.2。计算时考虑培养基体积，例如制备500mL需将各成分乘以0.5。

操作步骤：

  • 使用电子天平精确称量各成分。称量时戴手套，避免污染。
  • 示例：称量牛肉膏时，由于其为粘稠状，可先用少量热水溶解后称重，确保准确。
  • 将称好的成分置于烧杯中，加入约80%最终体积的蒸馏水（如500mL培养基加400mL水），搅拌溶解。

1.2 调节pH

使用pH计调节溶液至目标pH。环境工程微生物多为中性偏好，pH 7.0-7.2适宜大多数细菌。

操作步骤：

  • 将pH电极浸入溶液，读取数值。如果pH偏高，用1M HCl逐滴加入；如果偏低，用1M NaOH调节。
  • 示例：若溶液pH为6.5，加入0.1mL HCl后搅拌，再次测量，直至达到7.0。注意避免过量，导致沉淀。
  • 调节后，补加蒸馏水至最终体积（如500mL），充分搅拌。

1.3 分装与灭菌

将培养基分装至容器中，进行高压蒸汽灭菌以杀死所有微生物孢子。

操作步骤：

  • 使用移液管或分液器将培养基分装至培养皿（每皿约15-20mL）或试管（每管5mL）。分装时避免气泡。
  • 用棉花塞或硅胶盖封口，外包铝箔以防灭菌时水分蒸发。
  • 放入高压灭菌锅，设置121°C、15-20分钟。灭菌后，缓慢排气冷却至60°C左右。
  • 示例：灭菌后，若用于倾注平板，将培养基倒入无菌培养皿，轻轻摇动使均匀分布，冷却凝固后倒置存放于4°C冰箱备用。

注意事项：灭菌不彻底会导致污染；过度加热可能破坏营养成分。记录灭菌日期和批次。

第二部分：样品采集与预处理

环境工程微生物实验常从污水、土壤或活性污泥中采集样品。采样需代表性，避免二次污染。

2.1 样品采集

  • 工具：无菌采样瓶、移液器、手套。
  • 步骤：选择采样点（如污水处理厂曝气池），用无菌勺或移液器取样。污水样品需采集500mL，土壤样品取10-20g。
  • 示例：采集活性污泥时，先用无菌水冲洗采样工具，然后浸入污泥中取样，立即置于冰上运输至实验室（4小时内处理）。

2.2 预处理

  • 稀释：对于高浓度样品，进行系列稀释以获得可计数的菌落。使用无菌生理盐水（0.85% NaCl）作为稀释液。
  • 步骤：取1mL样品加入9mL生理盐水，混匀为10^-1稀释；继续稀释至10^-6。
  • 示例：污水样品10^-3稀释后，取0.1mL涂布于平板，可观察到单个菌落。

第三部分：分离纯化与培养

从混合样品中分离目标微生物，并通过纯化获得单一菌株。

3.1 分离方法

常用平板划线法或涂布法。

  • 平板划线法：

    • 步骤：在无菌条件下，用接种环蘸取样品，在营养琼脂平板上划线。第一区密集划线，第二区从第一区末端稀疏划线，依此类推。
    • 示例：从活性污泥样品划线，培养后观察孤立菌落。环境工程中，此法可分离降解苯酚的细菌。

  • 涂布法：

    • 步骤：取0.1mL稀释样品，均匀涂布于平板表面，用无菌涂布棒旋转涂匀。
    • 示例：对于土壤样品，涂布后培养24-48小时，观察菌落形态（如颜色、形状、边缘）。

3.2 培养条件

  • 将平板倒置于恒温培养箱中，温度30-37°C（根据微生物来源调整），时间24-72小时。
  • 环境工程特定：若筛选降解菌，可添加污染物（如染料）至培养基作为唯一碳源。
  • 示例：培养降解石油的细菌时，在NA中添加0.1%原油，观察生长情况。

3.3 纯化

  • 挑取单个菌落，转接到新鲜斜面或液体培养基中，重复划线直至纯度确认（镜检无杂菌）。
  • 步骤：用无菌接种针挑取菌落，接种至斜面，培养后保存于4°C。

第四部分：菌种鉴定

菌种鉴定结合形态学、生理生化和分子生物学方法。环境工程中，常鉴定如假单胞菌（Pseudomonas）等降解菌。

4.1 形态学观察

  • 显微镜检查：革兰氏染色法区分革兰氏阳性（G+，紫色）和阴性（G-，红色）。

    • 步骤：
      1. 涂片：取菌苔涂于载玻片，干燥固定。
      2. 初染：滴加结晶紫，染1分钟，水洗。
      3. 媒染：碘液1分钟，水洗。
      4. 脱色：95%乙醇30秒，水洗（G+不脱色）。
      5. 复染：番红1分钟，水洗，干燥镜检。
    • 示例：鉴定一株从污水分离的菌，若为G-短杆菌，可能为大肠杆菌或假单胞菌。

  • 菌落形态：记录大小、颜色、光泽等。如假单胞菌菌落常呈绿色荧光。

4.2 生理生化鉴定

  • 糖发酵试验：检测对葡萄糖、乳糖等的发酵能力。

    • 步骤：制备糖发酵管（蛋白胨水+1%糖+溴甲酚紫指示剂），接种菌株，培养24小时观察颜色变化（黄色为产酸）。
    • 示例：若菌株发酵葡萄糖产气，可能为肠杆菌科。

  • 氧化酶试验：检测细胞色素氧化酶。

    • 步骤：将菌株点种于氧化酶试纸，滴加1%四甲基对苯二胺，10秒内变紫为阳性。
    • 示例：假单胞菌通常阳性，可用于区分。

  • 其他：IMViC试验（吲哚、甲基红、VP、柠檬酸盐），用于肠道菌鉴定。

4.3 分子生物学鉴定（可选，高年级实验）

  • 16S rRNA基因测序：提取DNA，PCR扩增，测序比对。

    • 步骤：
      1. DNA提取：使用试剂盒（如Qiagen），裂解细胞，纯化。
      2. PCR：引物27F/1492R，反应体系：模板DNA 1μL，dNTPs 0.2mM，Taq酶0.5U，总体积50μL。程序：94°C 5min；30循环（94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 1min）；72°C 10min。
      3. 电泳：1%琼脂糖凝胶，100V 30min，观察条带。
      4. 测序：送样至公司，比对NCBI数据库。
    • 示例代码（伪代码，用于模拟PCR计算）：
    # 模拟PCR产物长度计算（实际需生物信息学工具）
def pcr_product_length(primer_forward_len=20, primer_reverse_len=20, template_len=1500):
    return template_len - primer_forward_len - primer_reverse_len


length = pcr_product_length()
print(f"预期PCR产物长度: {length} bp")  # 输出: 约1460 bp
    • 解释：此代码模拟计算PCR产物长度，帮助理解引物结合位置。实际实验中，使用BioEdit或Geneious软件分析序列。

  • 示例：鉴定一株降解苯的菌，通过16S测序确认为Pseudomonas putida，与数据库相似度>99%。

第五部分：数据记录与分析

  • 记录所有步骤：使用实验笔记本，记录日期、观察结果、照片。
  • 分析：计算菌落形成单位（CFU/mL）= 菌落数 × 稀释倍数 / 涂布体积。环境工程应用：评估污水处理效率，如菌株对COD的降解率。
  • 示例：若10^-4稀释样品有50个菌落，CFU=50 × 10^4 / 0.1 = 5 × 10^6 CFU/mL。

第六部分：安全与注意事项

  • 无菌操作：全程在超净台或火焰旁操作，戴口罩、手套。
  • 废弃物处理：培养物和染色废液需高压灭菌后丢弃。
  • 常见问题：污染时重新开始；生长不良时检查pH或温度。
  • 伦理：仅使用非致病菌，避免基因改造。

通过本指南，学生可系统掌握全流程，提升环境工程微生物应用能力。实验后，讨论结果与实际环境问题的联系，如微生物在湿地修复中的作用。