引言
微生物纯培养技术是微生物学研究和应用的基础，它指的是在无菌条件下，将单一微生物细胞或孢子分离出来，并在适宜的培养基中使其生长繁殖，形成一个由单一菌株组成的群体。这项技术广泛应用于环境监测、食品安全、医学诊断、工业发酵和基础科学研究等领域。从复杂的环境样本中分离出纯培养物，需要严谨的操作流程和严格的质量控制。本文将详细阐述从样本采集到单菌落分离的完整流程，并重点分析每个环节的关键控制点，以帮助读者掌握这项核心技术。
1. 样本采集与预处理
1.1 样本采集
样本采集是纯培养的第一步，其质量直接决定了后续分离的成败。采集时需遵循无菌原则，避免样本被外来微生物污染。
- 环境样本（如土壤、水体）：
- 土壤：使用灭菌的采样铲或土钻，采集表层土壤（0-20 cm）。将样本放入灭菌的密封袋或容器中，标记采样地点、深度、日期等信息。为避免交叉污染，每个采样点应使用独立的工具。
- 水体：使用灭菌的采水瓶或无菌注射器。对于表层水，可直接采集；对于深层水，需使用专用采水器（如南森采水器）。采集后立即冷藏（4°C）并尽快处理，以减少微生物群落的变化。
- 临床样本（如血液、痰液、伤口分泌物）：
- 严格遵守无菌操作，使用无菌棉签或注射器采集。血液样本需使用抗凝剂（如肝素钠）防止凝固。样本应立即送检或置于适宜的保存条件下（如37°C培养箱用于某些病原体）。
- 食品样本：
- 使用无菌工具采集不同部位（如表面、内部）。对于固体食品，需进行均质化处理（如用无菌剪刀剪碎后加入无菌生理盐水振荡）。
关键控制点：
- 无菌操作：所有采样工具和容器必须预先灭菌（高压蒸汽灭菌或干热灭菌）。
- 样本代表性：确保样本能代表目标微生物群落，避免局部偏差。
- 及时处理：样本采集后应尽快处理，或在适宜条件下保存（如4°C冷藏），以防止微生物群落变化或目标菌死亡。
1.2 样本预处理
根据样本类型和目标微生物，可能需要进行预处理以富集目标菌或去除抑制物。
- 均质化：对于固体样本（如土壤、食品），需将其与无菌稀释液（如磷酸盐缓冲液）混合，制成均匀的悬液。
- 过滤：对于含有大量颗粒或杂质的样本（如污水），可通过无菌滤膜（孔径通常为0.45 μm或0.22 μm）过滤，将微生物截留在滤膜上，然后将滤膜置于培养基表面进行培养。
- 富集培养：对于目标菌数量较少或生长缓慢的样本，可先进行富集培养。例如，从土壤中分离固氮菌时，可将土壤样本接种到无氮培养基中，培养一段时间以增加目标菌的数量。
关键控制点：
- 稀释梯度：如果样本中微生物浓度过高，需进行系列稀释（如10倍梯度稀释），以获得可计数的单菌落。稀释过程必须在无菌条件下进行，使用无菌移液器和稀释液。
- 抑制物去除：某些样本（如含有抗生素的土壤）可能含有抑制微生物生长的物质，需通过稀释、过滤或添加中和剂来去除。
2. 培养基的选择与制备
培养基是微生物生长的“土壤”，其成分直接影响目标菌的生长和分离。
2.1 培养基类型
- 基础培养基：如营养肉汤（NB）、营养琼脂（NA），适用于大多数异养微生物。
- 选择性培养基：通过添加特定成分（如抗生素、染料、特殊碳源）抑制非目标菌的生长，促进目标菌生长。例如：
- 麦康凯琼脂：含有胆盐和结晶紫，抑制革兰氏阳性菌，同时根据乳糖发酵能力区分大肠杆菌（红色菌落）和沙门氏菌（无色菌落）。
- LB琼脂：常用于大肠杆菌的培养，添加抗生素（如氨苄青霉素）可筛选携带抗性基因的菌株。
- 鉴别培养基：在培养基中添加指示剂（如酚红、溴甲酚紫），通过颜色变化区分不同微生物。例如，伊红美蓝琼脂（EMB）可区分大肠杆菌（金属光泽紫黑色菌落）和产气肠杆菌（粉色菌落）。
- 富集培养基：针对特定营养需求的微生物，如无氮培养基用于固氮菌，高盐培养基用于嗜盐菌。
2.2 培养基制备
- 称量与溶解：按配方称取各成分（如琼脂、蛋白胨、氯化钠），加入蒸馏水或去离子水，搅拌溶解。
- pH调节：使用pH计或pH试纸调节pH至适宜范围（通常为6.8-7.2），常用1M NaOH或HCl调节。
- 分装与灭菌：将培养基分装至锥形瓶或试管中，用封口膜或棉塞封口，高压蒸汽灭菌（121°C，15-20分钟）。注意液体培养基分装量不超过容器的2/3，固体培养基需在灭菌后趁热分装至培养皿。
- 倾注平板：待培养基冷却至约50°C（手感温热但不烫手）时，在无菌操作台中倾注至无菌培养皿中，每皿约15-20 mL。轻轻摇晃使培养基均匀铺开，静置凝固。
关键控制点：
- 成分准确性：严格按照配方称量，避免误差影响微生物生长。
- 灭菌彻底：确保灭菌温度和时间足够，防止杂菌污染。灭菌后需检查培养基是否澄清，有无沉淀或污染迹象。
- 无菌操作：所有步骤在无菌操作台中进行，避免空气中的微生物污染。
3. 接种与培养
3.1 接种方法
- 涂布法：适用于液体样本或稀释后的样本。用无菌涂布棒将样本均匀涂布在固体培养基表面。例如，将100 μL稀释后的土壤悬液涂布在LB琼脂平板上。
- 划线法：适用于从混合培养物中分离单菌落。用接种环蘸取样本，在固体培养基表面进行分区划线（通常分为四区）。第一区划线后，将接种环灭菌，再划第二区，依次类推，使菌液逐渐稀释，最终形成单菌落。
- 倾注法：将样本与熔化的琼脂培养基混合，倒入无菌培养皿中，凝固后培养。此方法可减少表面污染，但菌落可能分布在培养基内部，不易观察。
- 穿刺接种：用于观察细菌的运动性或深层生长情况，用接种针蘸取样本垂直刺入固体培养基深处。
3.2 培养条件
- 温度：根据目标微生物的最适生长温度选择，如37°C用于人体病原菌，25-30°C用于环境微生物。
- 气体环境：需氧菌在普通培养箱中培养；厌氧菌需在厌氧罐或厌氧工作站中培养，使用厌氧产气袋或气体置换法（如氮气、氢气、二氧化碳混合气）。
- 湿度：培养箱内保持一定湿度，防止培养基干燥。
- 培养时间：通常为24-48小时，但某些微生物（如放线菌）可能需要更长时间（数天至数周）。
关键控制点：
- 无菌操作：接种过程必须在无菌操作台中进行，使用火焰灭菌的接种环或无菌移液器。
- 培养条件控制：确保培养箱温度稳定，气体环境符合要求（如厌氧罐的氧气浓度%）。
- 防止污染：培养皿应倒置培养，防止冷凝水滴落污染菌落。
4. 单菌落分离与纯化
4.1 单菌落识别
在培养后，观察平板上的菌落形态（大小、形状、颜色、边缘、表面、透明度等）。单菌落应具有均一的形态，且周围无其他形态的菌落。例如，大肠杆菌在LB琼脂上形成圆形、光滑、湿润、乳白色的菌落。
4.2 纯化步骤
- 挑取单菌落：用无菌接种环挑取疑似单菌落，划线接种到新的选择性或鉴别培养基平板上，再次培养。
- 重复划线：通常需要重复2-3次划线分离，以确保获得纯培养物。每次划线后，观察菌落形态是否一致。
- 镜检验证：通过革兰氏染色和显微镜观察，确认菌体形态和染色特性是否一致。例如，革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
- 保存：将纯培养物接种到斜面培养基或液体培养基中，培养后置于4°C冰箱短期保存，或加入甘油制成甘油菌种长期保存于-80°C。
关键控制点：
- 单菌落选择：必须挑取形态均一、孤立的菌落，避免挑取多个菌落或污染菌落。
- 无菌操作：挑菌和划线过程需严格无菌，防止交叉污染。
- 验证纯度：通过形态观察、染色镜检和生化试验（如糖发酵试验）验证纯度。例如，大肠杆菌的纯培养物应能发酵乳糖产酸产气。
5. 常见问题与解决方案
5.1 无菌操作失误导致污染
- 问题：培养基或样本被外来微生物污染，出现多种形态菌落。
- 解决方案：加强无菌操作训练，确保操作台紫外灭菌时间足够（至少30分钟），使用无菌工具，避免说话或快速移动。
5.2 目标菌生长缓慢或不生长
- 问题：目标菌在培养基上不生长或生长缓慢。
- 解决方案：检查培养基成分是否正确，pH是否适宜，培养条件（温度、气体）是否合适。可尝试更换培养基或添加生长因子（如维生素、氨基酸）。
5.3 菌落形态不一致
- 问题：同一平板上菌落形态差异大，可能由于样本中存在多种微生物或污染。
- 解决方案：重新进行系列稀释，降低接种量，或使用选择性培养基抑制杂菌生长。
6. 应用实例：从土壤中分离固氮菌
6.1 样本采集
- 使用灭菌土钻采集农田表层土壤（0-10 cm），放入灭菌袋中，标记后冷藏运输。
6.2 预处理
- 称取10 g土壤，加入90 mL无菌生理盐水，振荡30分钟，制成10⁻¹悬液。
- 进行10倍梯度稀释至10⁻⁶。
6.3 培养基选择
- 使用无氮培养基（如阿什比培养基），其成分包括甘露醇、磷酸二氢钾、硫酸镁等，不含氮源，只有固氮菌能生长。
6.4 接种与培养
- 取10⁻⁴、10⁻⁵、10⁻⁶稀释液各0.1 mL，涂布于无氮琼脂平板上。
- 在28°C、好氧条件下培养5-7天。
6.5 单菌落分离
- 观察平板，固氮菌菌落通常较小、圆形、乳白色、粘稠。
- 挑取单菌落，划线接种到新鲜无氮培养基平板上，重复2次。
- 镜检观察菌体形态（通常为杆状或球状），并进行乙炔还原试验验证固氮能力。
6.6 关键控制点
- 无氮培养基的灭菌：甘露醇在高温下易分解，需采用过滤灭菌（0.22 μm滤膜）后加入已灭菌的培养基中。
- 厌氧条件：固氮菌为好氧菌，但需低氧环境，培养时可用透气封口膜。
7. 总结
微生物纯培养技术是一个系统工程，从样本采集到单菌落分离，每个环节都至关重要。无菌操作是贯穿始终的核心原则，培养基的选择和培养条件的控制直接影响目标菌的生长。通过严格的流程和关键控制点的把控，可以有效分离和纯化目标微生物，为后续研究和应用奠定基础。随着技术的发展，自动化设备（如菌落挑取仪）和分子生物学方法（如16S rRNA基因测序）正逐渐与传统纯培养技术结合，提高分离效率和准确性。掌握这些技术，将为微生物学研究和应用提供强大的工具。