引言

微生物学检验是临床诊断、疾病预防和公共卫生监测的核心环节。其准确性直接关系到患者的治疗效果和疾病控制策略的制定。一个完整的微生物学检验流程包括样本采集、运送、处理、培养、鉴定、药敏试验和结果判读等多个步骤。任何环节的失误都可能导致假阴性或假阳性结果，从而误导临床决策。本文将详细解析从样本采集到结果判读的全流程，旨在为检验人员、临床医生及相关从业者提供一份系统、实用的操作指南。

第一部分：样本采集——检验成功的基石

样本的质量是微生物学检验结果准确性的首要决定因素。不合格的样本，即使后续检验技术再先进，也难以得到可靠的结果。

1.1 采集原则

  • 无菌操作：严格遵守无菌原则，避免样本被皮肤或环境中的正常菌群污染。
  • 时机恰当：在抗生素使用前采集，或在用药后至少2-4小时（取决于药物半衰期）采集，以减少药物对微生物生长的抑制。
  • 部位准确：针对疑似感染部位采集，确保样本能代表病原体。
  • 足量采集：采集足够的样本量，以满足培养、涂片、分子检测等多种检验方法的需要。
  • 及时送检：大多数微生物样本对温度和时间敏感，需尽快送检。

1.2 常见样本类型及采集方法

1.2.1 血液样本

  • 适应症：怀疑菌血症、败血症、心内膜炎、不明原因发热等。
  • 采集方法：
    1. 皮肤消毒：使用70%酒精和碘伏（或氯己定）进行严格消毒，消毒范围直径至少5cm，待干。
    2. 采血：成人通常采集8-10mL血液，儿童1-3mL。使用专用血培养瓶（需氧瓶和厌氧瓶）。
    3. 关键点：采血量是影响血培养阳性率的关键因素。成人每瓶8-10mL，儿童每瓶1-3mL。采血量不足会导致假阴性。
  • 举例：一位疑似脓毒症的患者，医生开具血培养医嘱。护士在严格无菌操作下，从患者左上肢肘静脉采集8mL血液，分别注入需氧瓶和厌氧瓶各4mL。采血后立即送检，并在送检单上注明采血时间、部位和患者体温。

1.2.2 尿液样本

  • 适应症：尿路感染、肾盂肾炎等。
  • 采集方法：
    1. 清洁中段尿：女性患者先清洗外阴，分开阴唇，弃去前段尿，收集中段尿10-20mL于无菌容器中。男性患者清洗龟头后，收集中段尿。
    2. 导尿管尿液：对于无法自行排尿的患者，由医护人员在无菌操作下采集。
    3. 耻骨上膀胱穿刺：适用于婴幼儿或无法获得清洁中段尿的患者，是诊断尿路感染的金标准。
  • 关键点：避免尿液被尿道口正常菌群污染。样本应在采集后1小时内送检，否则需冷藏（2-8℃）。
  • 举例：一位老年女性患者出现尿频、尿急、尿痛。护士指导其进行清洁中段尿采集：先用肥皂水清洗外阴，再用清水冲洗，然后用无菌纱布擦干。患者排尿时，先弃去前10mL尿液，用无菌容器接取中段尿约15mL，立即送检。

1.2.3 痰液样本

  • 适应症：下呼吸道感染，如肺炎、支气管炎、肺结核等。
  • 采集方法：
    1. 自然咳痰：清晨起床后，用清水漱口数次，用力咳出深部的痰液（非唾液），置于无菌容器中。
    2. 诱导痰：对于无痰或痰少的患者，可使用雾化吸入生理盐水或高渗盐水诱导咳痰。
    3. 支气管镜下采集：通过支气管镜获取更直接的下呼吸道样本。
  • 关键点：痰液样本易被口腔正常菌群污染，需进行涂片镜检（如革兰染色）评估质量。合格痰液应在低倍镜下，每视野鳞状上皮细胞<10个，白细胞>25个。
  • 举例：一位社区获得性肺炎患者，医生要求留取痰培养。患者清晨漱口后，用力咳出黄色黏稠痰液约5mL，置于无菌痰盒中送检。检验人员收到样本后，立即进行涂片镜检，发现每视野鳞状上皮细胞5个，白细胞30个，判断为合格痰液，进行后续培养。

1.2.4 伤口分泌物/脓液样本

  • 适应症：皮肤软组织感染、手术切口感染、烧伤感染等。
  • 采集方法：
    1. 表面采样：对于浅表伤口，先用无菌生理盐水清洗伤口表面，再用无菌拭子在伤口深处或脓液最深处旋转擦拭。
    2. 深部采样：对于深部感染，可用注射器抽取脓液，或用手术刀切开后取组织样本。
  • 关键点：避免采集表面结痂或已干燥的分泌物。样本应避免接触消毒剂（如碘伏、酒精）。
  • 举例：一位糖尿病患者足部出现溃疡伴红肿流脓。医生用无菌注射器从溃疡深部抽取脓液2mL，注入无菌试管中送检。同时，用无菌拭子在溃疡边缘取样，用于涂片镜检。

1.2.5 脑脊液样本

  • 适应症：中枢神经系统感染，如脑膜炎、脑炎等。
  • 采集方法：
    1. 腰椎穿刺：由医生在严格无菌操作下进行，采集脑脊液。
    2. 采集顺序：通常采集4管，每管1-2mL。第1管用于化学和免疫学检查，第2管用于微生物学检查（培养和涂片），第3管用于细胞计数，第4管用于其他检查（如病毒检测）。
  • 关键点：脑脊液对温度和时间极为敏感，需立即送检（最好在30分钟内），并保温（35-37℃）送检，避免低温抑制细菌生长。
  • 举例：一位发热、头痛、颈强直的患者，医生进行腰椎穿刺。采集4管脑脊液，每管2mL。第2管立即送微生物室，检验人员进行涂片革兰染色和细菌培养。涂片发现革兰阴性杆菌，培养后鉴定为脑膜炎奈瑟菌。

1.2.6 其他样本

  • 粪便样本：用于肠道病原体检测（如沙门菌、志贺菌、弯曲菌、艰难梭菌毒素等）。采集时需取新鲜、有黏液或脓血的部分，避免尿液污染。
  • 生殖道样本：用于淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、支原体等检测。采集时需使用专用拭子（如女性宫颈拭子、男性尿道拭子）。
  • 组织样本：用于深部感染或肿瘤的微生物学检查。需在手术室或无菌条件下采集，立即送检或置于无菌转运培养基中。

1.3 样本标识与记录

  • 唯一标识：每个样本容器必须贴有清晰、唯一的标签，包括患者姓名、住院号/门诊号、样本类型、采集日期和时间。
  • 信息完整：送检单上需详细填写患者信息、临床诊断、采样部位、采样时间、用药情况等。
  • 举例：一份血培养瓶的标签应包含：患者姓名“张三”，住院号“2023001”，样本类型“血培养”，采集时间“2023-10-27 08:30”，采样部位“左肘静脉”。

第二部分：样本运送与接收

2.1 运送原则

  • 及时性：大多数样本应在采集后1-2小时内送检。特殊样本（如脑脊液、淋球菌拭子）需在30分钟内送检。
  • 温度控制：
    • 常温保存：血培养瓶、尿液、痰液、粪便等可在室温下运送。
    • 冷藏保存：需长时间运送（>2小时）的样本（如尿液、痰液）可冷藏（2-8℃），但脑脊液、淋球菌拭子等不可冷藏。
    • 保温保存：脑脊液、淋球菌拭子等需保温（35-37℃）送检。
  • 生物安全：样本应置于防漏、防破损的容器中，并放入生物安全袋或专用转运箱，避免污染环境。

2.2 实验室接收与处理

  • 接收标准：实验室人员接收样本时，需检查样本标识是否清晰、完整，样本量是否足够，容器是否完好，有无泄漏或污染。
  • 拒收标准：对于不合格样本（如标识不清、样本量不足、容器破损、严重污染、送检超时等），实验室应拒收并通知临床重新采集。
  • 登记与分发：接收合格样本后，立即登记并分发至相应检验岗位。

第三部分：样本处理与培养

3.1 样本预处理

  • 均质化：对于痰液、脓液等黏稠样本，需进行均质化处理。常用方法包括：
    • 涡旋振荡：将样本与等量或适量的无菌生理盐水或消化液（如N-乙酰半胱氨酸）混合，涡旋振荡1-2分钟。
    • 超声破碎：对于组织样本，可使用超声破碎仪破碎细胞。
  • 稀释：对于高浓度样本（如尿液），可进行适当稀释，以便于培养和计数。
  • 浓缩：对于低浓度样本（如脑脊液），可进行离心浓缩，提高检出率。

3.2 培养基选择

  • 常用培养基：
    • 血琼脂平板：基础培养基，支持大多数细菌生长，可观察溶血现象。
    • 巧克力琼脂平板：用于培养嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌等需要X因子和V因子的细菌。
    • 麦康凯/伊红美蓝平板：用于分离肠道革兰阴性杆菌。
    • 沙保弱培养基：用于真菌培养。
    • 厌氧培养基：如厌氧血琼脂平板，用于厌氧菌培养。
  • 选择性培养基：针对特定病原体，如：
    • SS琼脂：用于分离沙门菌和志贺菌。
    • TCBS琼脂：用于分离霍乱弧菌。
    • BCYE琼脂：用于分离军团菌。
    • Campy-Cefex平板：用于分离弯曲菌。

3.3 接种与培养条件

  • 接种方法：
    • 平板划线法：最常用，用于分离单个菌落。操作时，用无菌接种环蘸取样本，在平板表面分区划线，确保菌落分散。
    • 液体培养基接种：用于增菌培养，如血培养瓶、肉汤培养基。
  • 培养条件：
    • 温度：大多数细菌在35-37℃培养，真菌在25-30℃培养，嗜冷菌在20-25℃培养。
    • 气体环境：
      • 需氧菌：普通大气环境（含氧约21%）。
      • 厌氧菌：需在厌氧罐或厌氧工作站中培养，环境氧含量%。
      • 微需氧菌：如弯曲菌，需在低氧（5-10% O₂）、高二氧化碳（5-10% CO₂）环境中培养。
      • 二氧化碳培养箱：用于培养嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌等，通常设置为5-10% CO₂。
    • 培养时间：一般细菌培养24-48小时，真菌培养1-4周，结核分枝杆菌培养2-8周。

3.4 培养结果观察

  • 菌落特征：观察菌落的大小、形状、颜色、边缘、表面、溶血性等。
    • 溶血性：β溶血（完全溶血，菌落周围透明）、α溶血（不完全溶血，草绿色环）、γ溶血（不溶血）。
    • 色素：如金黄色葡萄球菌产生金黄色色素，铜绿假单胞菌产生绿色色素。
  • 举例：在血琼脂平板上，观察到一个直径约1-2mm、圆形、凸起、表面光滑、边缘整齐、产生β溶血的菌落，初步怀疑为链球菌或葡萄球菌。

第四部分：微生物鉴定

4.1 形态学鉴定

  • 革兰染色：最常用的染色方法，将细菌分为革兰阳性（紫色）和革兰阴性（红色）。
    • 操作步骤：涂片→固定→结晶紫染色→碘媒染→酒精脱色→复红染色→镜检。
    • 举例：痰液涂片革兰染色后，镜下见大量革兰阳性球菌，呈葡萄串状排列，初步怀疑为葡萄球菌。
  • 其他染色：
    • 抗酸染色：用于鉴定结核分枝杆菌等抗酸杆菌（红色）。
    • 墨汁负染：用于观察新型隐球菌的荚膜。
    • 芽孢染色：用于观察芽孢杆菌的芽孢。

4.2 生化鉴定

  • 原理：利用细菌对不同糖类、氨基酸等的代谢能力差异进行鉴定。
  • 常用方法：
    • 手工生化试验：如氧化酶试验、触酶试验、凝固酶试验、糖发酵试验等。
    • 自动化鉴定系统：如VITEK 2 Compact、BD Phoenix等，可快速鉴定细菌。
  • 举例：鉴定金黄色葡萄球菌：
    1. 革兰染色：革兰阳性球菌，葡萄串状排列。
    2. 触酶试验：阳性（产生气泡）。
    3. 凝固酶试验：阳性（血浆凝固）。
    4. 甘露醇发酵试验：阳性（培养基变黄）。
    5. 结合菌落特征（金黄色色素），最终鉴定为金黄色葡萄球菌。

4.3 质谱鉴定（MALDI-TOF MS）

  • 原理：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱，通过检测微生物蛋白质指纹图谱进行鉴定。
  • 优点：快速（几分钟）、准确、成本低。
  • 操作：将菌落涂在靶板上，加基质，放入质谱仪，获得图谱并与数据库比对。
  • 举例：从血培养阳性瓶中分离出一株细菌，通过MALDI-TOF MS鉴定，5分钟内得出结果为大肠埃希菌，置信度99.9%。

4.4 分子生物学鉴定

  • PCR：针对特定病原体的特异性基因进行扩增检测。
    • 举例：对于疑似结核病患者，可进行结核分枝杆菌特异性基因（如IS6110）的PCR检测，快速诊断。
  • 基因测序：16S rRNA基因测序是细菌鉴定的金标准，尤其适用于罕见菌或难培养菌。
    • 举例：一株从伤口分泌物中分离的细菌，生化鉴定不明确，通过16S rRNA基因测序，鉴定为一种罕见的放线菌。

第五部分：药敏试验

5.1 试验目的

  • 确定病原体对各类抗菌药物的敏感性，指导临床合理用药。
  • 监测耐药菌的流行趋势。

5.2 常用方法

  • 纸片扩散法（Kirby-Bauer法）：
    • 原理：将含药纸片贴在涂有菌液的琼脂平板上，药物扩散形成抑菌圈，测量抑菌圈直径，判断敏感、中介或耐药。
    • 操作：用无菌棉签蘸取0.5麦氏浊度的菌液，均匀涂布于M-H琼脂平板上，贴上药敏纸片，35℃培养16-18小时后测量。
    • 举例：对大肠埃希菌进行药敏试验，测量环丙沙星的抑菌圈直径为22mm，根据CLSI标准，判定为敏感（S）。
  • 稀释法：
    • 肉汤稀释法：将抗菌药物倍比稀释，加入菌液，培养后观察最低抑菌浓度（MIC）。
    • 琼脂稀释法：将抗菌药物混入琼脂中，接种菌液，培养后观察MIC。
    • 举例：对金黄色葡萄球菌进行万古霉素MIC测定，肉汤稀释法测得MIC为1μg/mL，判定为敏感。
  • 自动化系统：如VITEK 2、BD Phoenix，可同时进行鉴定和药敏试验，自动判读结果。

5.3 特殊药敏试验

  • ESBLs检测：对大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌等进行超广谱β-内酰胺酶检测，常用双纸片协同试验或CLSI推荐方法。
  • MRSA检测：对金黄色葡萄球菌进行甲氧西林耐药性检测，常用头孢西丁纸片法或PCR检测mecA基因。
  • VRE检测：对肠球菌进行万古霉素耐药性检测，常用纸片扩散法或PCR检测vanA、vanB基因。

5.4 结果判读标准

  • 参考标准：主要依据CLSI（美国临床实验室标准化协会）或EUCAST（欧洲抗菌药物敏感性试验委员会）标准。
  • 判读指标：
    • 敏感（S）：常规剂量下，药物在感染部位能达到有效浓度，治疗可能有效。
    • 中介（I）：药物在感染部位可能达到有效浓度，但需提高剂量或在特定部位使用。
    • 耐药（R）：常规剂量下，药物在感染部位不能达到有效浓度，治疗无效。
  • 举例：根据CLSI标准，对肺炎链球菌的青霉素纸片扩散法，抑菌圈直径≥20mm为敏感，≤19mm为中介或耐药（需进一步MIC测定）。

第六部分：结果判读与报告

6.1 结果整合

  • 综合分析：将培养结果、鉴定结果、药敏结果与临床信息（症状、体征、影像学、其他检查）结合分析。
  • 区分污染与感染：
    • 污染：常见于皮肤正常菌群（如凝固酶阴性葡萄球菌、棒状杆菌）在无菌部位样本中出现，或多种细菌混合生长。
    • 感染：单一优势菌生长，或与临床表现相符的病原体。
  • 举例：一位患者血培养报告为“凝固酶阴性葡萄球菌”，但患者无发热、无感染迹象，且采血时皮肤消毒不严格，可能为皮肤污染。需结合临床重新评估。

6.2 报告内容

  • 基本信息：患者信息、样本类型、采集时间、报告时间。
  • 微生物学结果：
    • 培养结果：如“血培养阳性，生长细菌”。
    • 鉴定结果：如“金黄色葡萄球菌”。
    • 药敏结果：以表格形式列出，包括药物名称、MIC值、抑菌圈直径、判读结果（S/I/R）。
  • 备注与建议：
    • 污染提示：如“凝固酶阴性葡萄球菌，可能为皮肤污染，建议结合临床”。
    • 耐药机制提示：如“该菌株产ESBLs，建议避免使用青霉素类、头孢菌素类”。
    • 治疗建议：如“根据药敏结果，建议使用万古霉素或利奈唑胺”。
  • 举例：一份血培养报告单： 
    
患者：张三，住院号2023001
样本：血培养
采集时间：2023-10-27 08:30
报告时间：2023-10-28 10:00
培养结果：阳性（需氧瓶和厌氧瓶均阳性）
鉴定结果：大肠埃希菌
药敏结果：
药物        MIC(μg/mL)  判读
氨苄西林      >32        R
头孢曲松      >4         R
庆大霉素      2          S
环丙沙星      0.5        S
亚胺培南      0.5        S
备注：该菌株产ESBLs，建议使用碳青霉烯类（如亚胺培南）或氨基糖苷类（如庆大霉素）治疗。

6.3 临床沟通

  • 危急值报告：对于危急结果（如血培养阳性、脑脊液培养阳性、多重耐药菌等），需立即电话通知临床医生。
  • 结果解释：检验人员应主动与临床医生沟通，解释结果的意义，提供治疗建议。
  • 举例：检验人员发现血培养阳性，鉴定为MRSA，立即电话通知主管医生：“您好，患者张三的血培养已阳性，鉴定为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA），建议使用万古霉素或利奈唑胺治疗。”

第七部分：质量控制与生物安全

7.1 质量控制

  • 室内质控：每天对培养基、染色液、试剂、仪器进行质控，确保性能稳定。
  • 室间质评：定期参加国家或省级室间质评，评估实验室检测水平。
  • 举例：每天用标准菌株（如大肠埃希菌ATCC 25922）对血琼脂平板进行质控，观察菌落形态、溶血性是否符合预期。

7.2 生物安全

  • 个人防护：检验人员需穿戴白大褂、手套、口罩，必要时佩戴护目镜或面罩。
  • 实验室分区：清洁区、半污染区、污染区分开，避免交叉污染。
  • 废弃物处理：所有微生物样本、培养物、废弃物需经高压灭菌或化学消毒后处理。
  • 举例：处理阳性血培养瓶时，需在生物安全柜中操作，操作后废弃物放入专用容器，经高压灭菌后再丢弃。

第八部分：新技术与发展趋势

8.1 分子诊断技术

  • 多重PCR：可同时检测多种病原体，如呼吸道病原体多重PCR检测。
  • 宏基因组测序（mNGS）：无需培养，直接对样本中所有微生物核酸进行测序，适用于疑难、罕见感染。
  • 举例：一位不明原因发热患者，传统培养阴性，通过mNGS检测，发现为巴尔通体感染，指导了精准治疗。

8.2 自动化与智能化

  • 全自动血培养系统：如BACTEC、BacT/ALERT，可连续监测，缩短阳性报警时间。
  • 全自动鉴定/药敏系统：如VITEK 2、BD Phoenix，实现高通量、自动化检测。
  • 人工智能辅助判读：利用AI算法分析菌落图像、药敏结果，提高判读效率和准确性。

8.3 快速检测技术

  • 抗原检测：如流感病毒抗原检测，快速（15分钟）但灵敏度较低。
  • 核酸扩增检测（NAAT）：如PCR、LAMP，快速、灵敏、特异，已广泛应用于病原体检测。
  • 举例：对于疑似流感患者，可使用流感病毒核酸检测试剂盒，30分钟内出结果，指导早期抗病毒治疗。

结语

微生物学检验是一个严谨、系统的过程，从样本采集到结果判读，每个环节都至关重要。随着技术的不断进步，微生物学检验正朝着更快速、更准确、更智能的方向发展。然而，无论技术如何革新，检验人员的专业素养、严谨态度和与临床的紧密协作，始终是确保检验质量的核心。希望本指南能为相关从业者提供有价值的参考，共同提升微生物学检验水平，为患者健康保驾护航。

参考文献（示例）：

  1. 《临床微生物学检验技术》（人民卫生出版社）
  2. CLSI M100, Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing, 33rd Edition.
  3. EUCAST, Breakpoint Tables for Interpretation of MICs and Zone Diameters, Version 13.0.
  4. 《医疗机构临床微生物学检验标本采集与运送指南》（国家卫生健康委员会）