生物化学（Biochemistry）是生物学与化学的交叉学科，主要研究生命体内的化学分子、化学反应以及生物过程的分子机制。作为生命科学的基础学科，它不仅揭示了生命的本质，还为医学、药学、农业和工业提供了理论支持。本文将基于“小亮生物化学笔记”的视角，系统梳理生物化学的核心知识点，并结合实际实验技巧，帮助读者深入理解这一领域。文章内容力求详尽、通俗易懂，适合初学者和进阶学习者参考。

1. 生物化学概述：从分子层面理解生命

生物化学的核心在于从分子水平解释生命现象，包括蛋白质、核酸、碳水化合物和脂质等生物大分子的结构、功能和代谢途径。这些分子通过复杂的相互作用维持细胞的稳态和生物体的生存。

1.1 生物化学的研究范围

生物化学的研究范围广泛，主要包括：

  • 结构生物化学：研究生物分子的三维结构，如蛋白质的折叠和酶的活性位点。
  • 代谢生物化学：探讨能量转换和物质代谢，如糖酵解和三羧酸循环。
  • 分子生物学：涉及DNA复制、转录和翻译等遗传信息传递过程。
  • 酶学：专注于酶的催化机制和动力学。

这些领域相互交织，例如，理解蛋白质结构有助于解释其在代谢中的功能。根据最新研究（如2023年《Nature》上的蛋白质组学综述），生物化学正向系统生物学方向发展，整合大数据分析生命过程。

1.2 为什么学习生物化学？

学习生物化学有助于理解疾病机制（如糖尿病中的胰岛素信号通路）和开发药物（如靶向酶的抑制剂）。例如，在COVID-19疫情中，生物化学家通过分析病毒蛋白酶结构设计了抗病毒药物。掌握核心知识和实验技巧，能让你在科研或临床中游刃有余。

2. 生物大分子：生命的基石

生物大分子是生物化学的核心，它们由单体聚合而成，具有特定的结构和功能。以下详细解析蛋白质、核酸、碳水化合物和脂质。

2.1 蛋白质：功能的执行者

蛋白质是生命活动中最多样化的分子，由氨基酸通过肽键连接而成。其结构分为四个层次：

  • 一级结构：氨基酸序列，由基因决定。例如，血红蛋白的一级结构包含α和β链，突变可导致镰状细胞贫血。
  • 二级结构：局部折叠，如α-螺旋和β-折叠，由氢键稳定。
  • 三级结构：整个多肽链的三维构象，涉及疏水作用、二硫键等。
  • 四级结构：多个亚基的组装，如血红蛋白的四聚体。

蛋白质的功能包括催化（酶）、运输（血红蛋白）和信号传导（G蛋白偶联受体）。实验中，常用X射线晶体学或冷冻电镜解析结构。

实验技巧：蛋白质纯化是关键步骤。标准流程包括细胞裂解、盐析和柱层析。例如，使用His-tag融合蛋白进行镍柱亲和层析：

# 伪代码示例：蛋白质纯化流程（实际实验需在实验室进行）
1. 裂解细胞：使用超声波破碎大肠杆菌表达菌体。
2. 离心：10,000g离心20min，收集上清。
3. 上样：将上清加载到Ni-NTA柱，His-tag蛋白结合。
4. 洗涤：用20mM咪唑缓冲液洗去杂质。
5. 洗脱：用250mM咪唑洗脱目标蛋白。
6. 验证：SDS-PAGE电泳检测纯度。

通过SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）可评估纯度，条带单一即为纯蛋白。

2.2 核酸：遗传信息的载体

核酸包括DNA和RNA，由核苷酸组成。DNA是双螺旋结构，碱基配对遵循A-T、G-C规则；RNA则为单链，参与蛋白质合成。

  • DNA复制：半保留复制，由DNA聚合酶催化。涉及引物合成、链延伸和校对。
  • RNA类型：mRNA（信使RNA）、tRNA（转运RNA）和rRNA（核糖体RNA）。

实验技巧：PCR（聚合酶链式反应）是核酸扩增的标准方法。详细步骤如下（使用Taq酶）：

# PCR反应体系（总体系50μL）
- 模板DNA: 1μL (10ng/μL)
- 正向引物: 1μL (10μM)
- 反向引物: 1μL (10μM)
- dNTPs: 4μL (2.5mM each)
- Taq酶: 0.25μL (5U/μL)
- 10x PCR buffer: 5μL
- ddH2O: 27.75μL

# PCR程序
1. 预变性: 95°C, 5min
2. 变性: 95°C, 30s
3. 退火: 55-65°C (根据引物Tm值), 30s
4. 延伸: 72°C, 1kb/min
5. 循环: 步骤2-4重复30-35次
6. 终延伸: 72°C, 10min
7. 保存: 4°C

优化退火温度可提高特异性；琼脂糖凝胶电泳验证产物大小。

2.3 碳水化合物和脂质

碳水化合物（如葡萄糖）提供能量，结构包括单糖、寡糖和多糖（如淀粉、纤维素）。脂质则包括甘油三酯（能量储存）和磷脂（细胞膜组成）。

实验技巧：测定葡萄糖浓度使用葡萄糖氧化酶法（GOD-PAP法），原理是葡萄糖在酶催化下产生H2O2，与显色剂反应生成有色产物，通过分光光度计读取吸光度（505nm）。

3. 酶学：生物化学的催化剂

酶是生物催化剂，加速反应速率而不改变平衡。其高效性源于降低活化能和特异性。

3.1 酶的分类与机制

酶按EC编号分为六大类：氧化还原酶、转移酶、水解酶等。机制包括诱导契合模型（酶与底物结合时构象变化）。

3.2 酶动力学：米氏方程

酶促反应速率遵循Michaelis-Menten方程：v = (Vmax * [S]) / (Km + [S])，其中v为反应速率，Vmax为最大速率，Km为米氏常数（底物亲和力指标），[S]为底物浓度。

详细例子：假设一种酶的Vmax = 100 μmol/min，Km = 10 mM。当[S] = 10 mM时，v = 50 μmol/min（半最大速率）。Lineweaver-Burk双倒数作图可线性化：1/v = (Km/Vmax)(1/[S]) + 1/Vmax。

实验技巧：测定Km和Vmax需进行底物浓度梯度实验。步骤：

  1. 准备底物浓度系列（如0.1, 0.5, 1, 5, 10, 20 mM）。
  2. 在固定酶量下测量初始速率（使用分光光度计监测产物生成）。
  3. 绘制v vs [S]曲线，拟合米氏方程。
  4. 使用软件如GraphPad Prism计算参数。

常见问题：底物抑制时，曲线呈钟形，需调整模型。

4. 代谢途径：能量与物质的转换

代谢分为分解代谢（释放能量）和合成代谢（消耗能量）。核心途径包括糖酵解、三羧酸循环和氧化磷酸化。

4.1 糖酵解（Glycolysis）

在细胞质中，1分子葡萄糖分解为2分子丙酮酸，净产生2 ATP和2 NADH。关键酶：己糖激酶、磷酸果糖激酶。

详细步骤（10步反应）：

  1. 葡萄糖 → 葡萄糖-6-磷酸（己糖激酶，消耗1 ATP）。
  2. 葡萄糖-6-磷酸 → 果糖-6-磷酸（磷酸葡萄糖异构酶）。
  3. 果糖-6-磷酸 → 果糖-1,6-二磷酸（磷酸果糖激酶，消耗1 ATP）。
  4. 裂解为甘油醛-3-磷酸和二羟丙酮磷酸。
  5. 甘油醛-3-磷酸 → 1,3-二磷酸甘油酸（产生1 NADH）。 6-10. 后续步骤产生2 ATP（底物水平磷酸化）。

净反应：Glucose + 2ADP + 2Pi + 2NAD+ → 2Pyruvate + 2ATP + 2NADH + 2H+ + 2H2O。

实验技巧：测定糖酵解速率使用酶偶联法。例如，监测NADH在340nm吸光度变化（NADH在340nm有特征吸收）。在细胞提取物中添加底物，记录吸光度下降速率。

4.2 三羧酸循环（TCA循环）

在线粒体基质中，丙酮酸经氧化脱羧生成乙酰CoA，进入TCA循环。循环产生3 NADH、1 FADH2和1 GTP（相当于ATP），并释放2 CO2。

关键步骤：

  1. 乙酰CoA + 草酰乙酸 → 柠檬酸（柠檬酸合酶）。
  2. 异柠檬酸 → α-酮戊二酸（产生NADH）。
  3. α-酮戊二酸 → 琥珀酰CoA（产生NADH）。
  4. 琥珀酰CoA → 琥珀酸（产生GTP）。
  5. 琥珀酸 → 延胡索酸（产生FADH2）。
  6. 苹果酸 → 草酰乙酸（产生NADH）。

总输出：每分子乙酰CoA产生10 ATP（通过后续氧化磷酸化）。

实验技巧：TCA循环酶活性测定使用分光光度法。例如，柠檬酸合酶活性通过监测CoA-SH与DTNB试剂反应生成黄色产物（412nm吸光度）。反应体系：草酰乙酸、乙酰CoA、Tris缓冲液，37°C孵育，记录初始速率。

4.3 氧化磷酸化

电子传递链（ETC）将NADH和FADH2的电子传递给O2，产生质子梯度驱动ATP合成。复合物I-IV参与，ATP合酶催化ADP + Pi → ATP。

实验技巧：测定线粒体呼吸使用氧电极。步骤：分离线粒体（差速离心），添加底物（如琥珀酸），监测O2消耗速率。抑制剂如鱼藤酮可阻断复合物I，帮助定位问题。

5. 分子生物学基础：遗传信息的流动

分子生物学是生物化学的延伸，中心法则描述DNA → RNA → 蛋白质的信息流动。

5.1 DNA复制、转录和翻译

  • 复制：半保留，需引物酶和连接酶。
  • 转录：RNA聚合酶合成mRNA，真核生物涉及启动子和增强子。
  • 翻译：核糖体读取mRNA密码子，tRNA携带氨基酸，形成多肽链。

实验技巧：Western Blot检测蛋白质表达。详细步骤：

  1. SDS-PAGE电泳分离蛋白。
  2. 转膜至PVDF膜（湿转或半干转）。
  3. 封闭：5%脱脂奶粉，1h。
  4. 一抗孵育：4°C过夜。
  5. 二抗孵育：HRP标记，1h。
  6. 显色：ECL试剂，化学发光成像。

优化：调整抗体浓度，避免非特异性结合。

6. 实验技巧与常见问题解决

生物化学实验强调精确性和重复性。以下总结通用技巧。

6.1 缓冲液选择

缓冲液维持pH稳定。常用：Tris-HCl（pH 7-9）、磷酸盐（pH 6-8）、HEPES（生理pH）。例如，酶反应常用50mM Tris-HCl，pH 7.5。

技巧：计算缓冲能力，确保浓度足够（10-100mM）。避免金属离子干扰酶活性。

6.2 蛋白质定量

Bradford法（考马斯亮蓝）是标准方法。原理：染料与蛋白结合变蓝，595nm测吸光度。

详细例子：标准曲线绘制：BSA浓度0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mg/mL，测量吸光度，线性回归求未知样品浓度。

6.3 常见问题与解决

  • 蛋白沉淀：添加甘油或优化盐浓度。
  • PCR污染：使用无菌操作，添加UNG酶。
  • 酶失活：低温操作，添加保护剂如DTT（还原剂）。

6.4 安全与伦理

实验中戴手套、护目镜；涉及动物或人类样本需伦理批准。最新指南（如WHO 2023）强调生物安全级别（BSL-2 for病原体）。

7. 结语：应用与展望

生物化学的核心知识与实验技巧是理解生命的钥匙。从蛋白质结构到代谢网络，这些内容不仅基础，还驱动创新，如基因编辑（CRISPR）和合成生物学。建议结合最新文献（如PubMed搜索“biochemistry review 2023”）深化学习。通过实践实验，你能将理论转化为技能，为科研或职业发展奠基。如果有特定主题疑问，欢迎进一步探讨！