引言

细菌耐药性已成为全球公共卫生的重大挑战。世界卫生组织（WHO）将抗生素耐药性列为21世纪人类健康面临的十大威胁之一。在临床微生物学中，抑菌圈牛津杯实验（又称牛津杯法或管碟法）是一种经典的体外抗菌药物敏感性测试方法，广泛应用于测定细菌对抗生素的敏感性，为临床合理用药提供重要依据。本文将详细介绍该实验的原理、操作步骤、结果解读及其在临床指导中的应用，并结合实例说明如何通过该实验精准测定细菌耐药性。

一、抑菌圈牛津杯实验的基本原理

抑菌圈牛津杯实验基于扩散原理，通过测量抗生素在琼脂培养基中扩散形成的抑菌圈直径，来评估细菌对抗生素的敏感性。其核心原理是：将含有一定浓度抗生素的牛津杯（一种不锈钢或玻璃制成的圆柱形小管）放置在涂布了待测细菌的琼脂平板上，抗生素从牛津杯中向周围琼脂扩散，形成浓度梯度。当抗生素浓度达到或超过细菌的最小抑菌浓度（MIC）时，细菌生长被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈直径与抗生素浓度呈正相关，与细菌的耐药性呈负相关。

1.1 实验关键要素

  • 牛津杯：通常为内径6.0±0.1 mm、外径8.0±0.1 mm、高度10.0±0.1 mm的圆柱形小管，材质为不锈钢或玻璃，需无菌处理。
  • 琼脂培养基：常用Mueller-Hinton琼脂（MHA），其成分和厚度（通常为4 mm）需标准化，以确保抗生素扩散的一致性。
  • 抗生素溶液：需使用标准浓度的抗生素储备液，根据实验目的稀释至工作浓度（如10 μg/mL的氨苄西林）。
  • 待测细菌：临床分离的细菌菌株，需新鲜培养至对数生长期（通常为18-24小时）。

1.2 实验的局限性

  • 仅适用于需氧或兼性厌氧菌，对厌氧菌或苛养菌需调整培养条件。
  • 结果受多种因素影响，如培养基厚度、pH值、温度等，需严格标准化操作。
  • 不能直接测定MIC，但可通过标准曲线或参考CLSI（临床和实验室标准协会）指南进行换算。

二、实验操作步骤详解

以下以测定金黄色葡萄球菌对青霉素的敏感性为例，详细说明操作流程。

2.1 材料准备

  • 细菌培养：将临床分离的金黄色葡萄球菌接种于血琼脂平板，35°C培养18-24小时，挑取单个菌落制备0.5麦氏浊度（约1.5×10^8 CFU/mL）的菌悬液。
  • 琼脂平板制备：将Mueller-Hinton琼脂加热融化后，倾注至无菌平皿中，厚度约4 mm（约25 mL/90 mm平皿），冷却凝固后备用。
  • 抗生素溶液配制：用无菌生理盐水将青霉素储备液（如1 mg/mL）稀释至工作浓度（如10 μg/mL），现配现用。

2.2 接种与放置牛津杯

  1. 涂布细菌：用无菌棉签蘸取0.5麦氏浊度的菌悬液，均匀涂布于琼脂平板表面，静置5-10分钟使菌液吸收。
  2. 放置牛津杯：用无菌镊子将牛津杯轻轻放置于琼脂平板上，每个平板可放置4-6个牛津杯，间距至少20 mm，以避免抑菌圈重叠。
  3. 加入抗生素：用微量移液器将100 μL抗生素溶液（10 μg/mL青霉素）加入牛津杯中，确保溶液充满牛津杯且无溢出。

2.3 培养与观察

  • 将平板置于35°C培养箱中培养16-18小时（金黄色葡萄球菌）。
  • 培养后，用游标卡尺或专用测量仪测量抑菌圈直径（包括牛津杯外径），精确至0.1 mm。
  • 记录每个牛津杯的抑菌圈直径，并计算平均值。

2.4 结果判定

根据CLSI M100指南（2023版），金黄色葡萄球菌对青霉素的敏感性判定标准如下：

  • 敏感（S）：抑菌圈直径≥29 mm（对应MIC≤0.12 μg/mL）。
  • 中介（I）：抑菌圈直径20-28 mm（对应MIC 0.25-0.5 μg/mL）。
  • 耐药（R）：抑菌圈直径≤19 mm（对应MIC≥1 μg/mL）。

示例：若测得抑菌圈直径为25 mm，则判定为中介（I），提示该菌株对青霉素敏感性降低，临床需考虑使用更高剂量或替代抗生素。

三、实验结果的精准解读与耐药性分析

3.1 抑菌圈直径与MIC的换算

虽然牛津杯法不能直接测定MIC，但可通过标准曲线或参考CLSI指南进行估算。例如，对于大肠埃希菌对环丙沙星的测定，CLSI提供了抑菌圈直径与MIC的对应关系表。

示例：若大肠埃希菌对环丙沙星的抑菌圈直径为22 mm，根据CLSI指南，对应MIC为0.25 μg/mL（敏感），而若抑菌圈直径为15 mm，则对应MIC为4 μg/mL（耐药）。

3.2 耐药机制的初步推断

抑菌圈的形态可提供耐药机制的线索：

  • 均匀抑菌圈：通常提示细菌对药物敏感，无明显耐药机制。
  • 模糊或不规则抑菌圈：可能提示细菌产生β-内酰胺酶（如金黄色葡萄球菌对青霉素），导致药物在扩散过程中被降解。
  • 双圈现象：内圈小、外圈大，可能提示细菌存在两种耐药机制，如同时产生β-内酰胺酶和外排泵。

实例分析：在测定铜绿假单胞菌对亚胺培南的敏感性时，若出现双圈现象（内圈直径10 mm，外圈直径20 mm），可能提示该菌株同时产生金属β-内酰胺酶和外排泵，导致对亚胺培南的耐药性增强。此时需进一步进行分子检测（如PCR检测blaIMP或blaVIM基因）确认。

3.3 多重耐药菌的检测

对于多重耐药菌（如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，MRSA），牛津杯法可同时测试多种抗生素。例如，对MRSA的检测，可同时测试苯唑西林、万古霉素、利奈唑胺等，通过比较抑菌圈直径，评估其耐药谱。

示例：某MRSA菌株对苯唑西林的抑菌圈直径为6 mm（耐药），对万古霉素的抑菌圈直径为18 mm（敏感），对利奈唑胺的抑菌圈直径为20 mm（敏感）。这表明该菌株对β-内酰胺类耐药，但对糖肽类和噁唑烷酮类敏感，临床可选用万古霉素或利奈唑胺治疗。

四、牛津杯法在临床指导用药中的应用

4.1 指导个体化治疗

牛津杯法可为临床医生提供个体化的抗生素选择依据。例如，对于重症肺炎患者，若痰培养分离出肺炎克雷伯菌，通过牛津杯法测定其对头孢曲松、左氧氟沙星、阿米卡星的敏感性，可快速筛选出有效药物。

实例：某患者痰培养分离出肺炎克雷伯菌，牛津杯法结果显示：头孢曲松抑菌圈直径15 mm（耐药），左氧氟沙星抑菌圈直径22 mm（敏感），阿米卡星抑菌圈直径20 mm（敏感）。临床医生据此选择左氧氟沙星或阿米卡星进行治疗，避免使用无效的头孢曲松。

4.2 监测耐药趋势

医院微生物实验室可定期使用牛津杯法监测常见病原菌的耐药率，为医院感染控制提供数据支持。例如，通过监测大肠埃希菌对氟喹诺酮类的耐药率，可评估当地耐药趋势，指导经验性用药。

实例：某医院2023年监测数据显示，大肠埃希菌对环丙沙星的耐药率从2022年的45%上升至55%，提示氟喹诺酮类药物在当地可能不再作为经验性用药的首选，应考虑改用其他药物如头孢曲松或阿米卡星。

4.3 指导联合用药

对于严重感染或耐药菌感染，牛津杯法可帮助评估联合用药的效果。例如，测定细菌对两种抗生素的联合抑菌圈，可判断是否存在协同作用。

实例：在测定铜绿假单胞菌对哌拉西林/他唑巴坦和阿米卡星的联合敏感性时，若联合用药的抑菌圈直径明显大于单一用药，提示可能存在协同作用，临床可考虑联合用药以增强疗效。

五、实验优化与质量控制

5.1 标准化操作

  • 培养基厚度：使用厚度测量仪确保琼脂厚度一致（4 mm），厚度偏差会导致抑菌圈直径变异。
  • 菌液浓度：严格控制菌液浓度为0.5麦氏浊度，浓度过高或过低均会影响结果。
  • 抗生素浓度：使用标准品配制抗生素溶液，避免使用过期或降解的抗生素。

5.2 质量控制

  • 质控菌株：每次实验需同时测试质控菌株（如金黄色葡萄球菌ATCC 25923、大肠埃希菌ATCC 25922），确保抑菌圈直径在CLSI允许范围内。
  • 重复性：每个菌株至少重复3次实验，取平均值以减少误差。
  • 环境控制：实验在20-25°C、湿度40-60%的环境中进行，避免温度波动影响扩散。

5.3 新技术结合

现代微生物实验室可将牛津杯法与自动化系统（如VITEK 2）结合，提高效率。例如，先用自动化系统快速筛选耐药表型，再用牛津杯法验证可疑结果。

六、实例分析：一例复杂感染的临床决策

6.1 病例背景

患者，男性，65岁，因尿路感染入院，尿培养分离出大肠埃希菌。患者有糖尿病史，近期使用过广谱抗生素，怀疑为多重耐药菌感染。

6.2 牛津杯法测定结果

实验室使用牛津杯法测定该菌株对常用抗生素的敏感性：

  • 氨苄西林：抑菌圈直径6 mm（耐药）
  • 头孢曲松：抑菌圈直径10 mm（耐药）
  • 环丙沙星：抑菌圈直径12 mm（耐药）
  • 阿米卡星：抑菌圈直径18 mm（敏感）
  • 呋喃妥因：抑菌圈直径22 mm（敏感）

6.3 临床决策

根据结果，该菌株对β-内酰胺类和氟喹诺酮类耐药，但对氨基糖苷类和呋喃妥因敏感。结合患者肾功能（肌酐清除率45 mL/min），临床选择呋喃妥因（口服）治疗，避免使用阿米卡星（肾毒性风险）。治疗后患者症状缓解，尿培养转阴。

6.4 经验总结

此案例表明，牛津杯法可快速提供耐药谱，指导临床选择安全有效的抗生素，避免盲目使用广谱药物，减少耐药性发展和不良反应。

七、牛津杯法的局限性及改进方向

7.1 局限性

  • 耗时：需18-24小时培养，无法满足急诊需求。
  • 主观性：抑菌圈边缘模糊时，测量可能存在主观误差。
  • 不适用于某些细菌：如厌氧菌、苛养菌（如流感嗜血杆菌）需特殊培养基。

7.2 改进方向

  • 自动化测量：使用图像分析软件自动测量抑菌圈直径，提高精度和效率。
  • 快速检测技术：结合分子生物学方法（如PCR检测耐药基因），缩短检测时间。
  • 微流控技术：开发微流控牛津杯装置，减少试剂用量，提高通量。

八、结论

抑菌圈牛津杯实验是一种经典、可靠的体外抗菌药物敏感性测试方法，通过精准测定细菌耐药性，为临床用药提供重要依据。尽管存在耗时长、主观性等局限性，但通过标准化操作、质量控制和新技术结合，可显著提高其准确性和实用性。在临床实践中，微生物实验室应结合患者具体情况和当地耐药趋势，合理应用牛津杯法，指导个体化治疗，共同应对细菌耐药性挑战。

参考文献

  1. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). M100: Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing, 33rd Edition. 2023.
  2. World Health Organization (WHO). Global Antimicrobial Resistance Surveillance System (GLASS) Report. 2022.
  3. 王辉, 任健康. 临床微生物学检验技术. 人民卫生出版社, 2021.
  4. Balouiri M, Sadiki M, Ibnsouda SK. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis, 2016, 6(2): 71-79.

（注：本文内容基于当前临床微生物学实践和CLSI指南，实验操作需在专业实验室由 trained personnel 执行。）