抑菌圈实验（又称琼脂扩散法或Kirby-Bauer法）是微生物学、药学及食品科学等领域中用于评估抗菌物质（如抗生素、植物提取物、消毒剂等）抑菌活性的经典方法。其核心原理是通过测量抗菌物质在琼脂培养基中扩散形成的透明抑菌圈直径，来定量或半定量地评价其抗菌效力。样品配置是实验成功的关键环节，直接影响结果的准确性和可重复性。本文将从原理、实操步骤、常见问题及解决方案等方面，对抑菌圈实验的样品配置进行详细解析。

一、 抑菌圈实验的基本原理

抑菌圈实验的原理基于扩散-抑制模型。具体过程如下：

  1. 扩散：将含有抗菌物质的样品（如滤纸片、牛津杯、打孔法）置于已接种指示菌的琼脂平板表面。在培养过程中，抗菌物质从样品点向四周琼脂中扩散，形成浓度梯度。
  2. 抑制：当抗菌物质的浓度达到或超过指示菌的最小抑菌浓度（MIC）时，该区域的细菌生长被抑制，形成一个透明的抑菌圈。
  3. 测量：抑菌圈的直径与抗菌物质的浓度、扩散系数及抗菌效力相关。在一定范围内，抑菌圈直径与抗菌物质浓度的对数呈线性关系，可用于定量分析。

关键影响因素：

  • 样品性质：抗菌物质的溶解度、扩散系数、稳定性。
  • 指示菌：菌种、菌龄、接种浓度。
  • 培养基：成分、厚度、pH值。
  • 培养条件：温度、时间、湿度。

二、 样品配置详解

样品配置是抑菌圈实验的核心，主要包括抗菌物质的准备、载体的选择与处理、样品的装载以及对照的设置。

1. 抗菌物质的准备

抗菌物质的溶解和浓度是样品配置的基础。

（1）溶剂选择

  • 原则：选择能完全溶解抗菌物质、且对指示菌无毒或低毒的溶剂。常用溶剂包括：
    • 水：适用于水溶性物质（如大多数抗生素、有机酸）。
    • 有机溶剂：如乙醇、甲醇、丙酮、DMSO（二甲基亚砜），适用于脂溶性物质（如某些植物精油、抗生素）。注意：有机溶剂需控制最终浓度（通常≤1% v/v），以免抑制指示菌生长。
    • 缓冲液：如磷酸盐缓冲液（PBS），用于维持pH稳定，尤其适用于对pH敏感的物质。

（2）浓度梯度设置

  • 定量分析：若需建立标准曲线，需配置一系列浓度梯度（如5个浓度点），通常按对数或等比稀释。

  • 定性/半定量分析：可选择一个或几个代表性浓度。

  • 示例：配置青霉素G的浓度梯度。

    • 母液：用无菌水配制1000 μg/mL的青霉素G母液。
    • 梯度：用无菌水或PBS稀释至0.5、1、2、4、8 μg/mL等浓度。
    • 代码示例（Python）：以下代码可用于计算稀释所需的体积。
    # 计算稀释所需体积
def calculate_dilution(initial_conc, final_conc, final_volume):
    """
    计算稀释所需体积
    :param initial_conc: 初始浓度 (μg/mL)
    :param final_conc: 目标浓度 (μg/mL)
    :param final_volume: 最终体积 (mL)
    :return: 所需母液体积 (mL)
    """
    if initial_conc <= final_conc:
        raise ValueError("初始浓度必须大于目标浓度")
    required_volume = (final_conc / initial_conc) * final_volume
    return required_volume

# 示例：从1000 μg/mL母液稀释至4 μg/mL，最终体积10 mL
initial_conc = 1000  # μg/mL
final_conc = 4       # μg/mL
final_volume = 10    # mL
volume_needed = calculate_dilution(initial_conc, final_conc, final_volume)
print(f"需要母液体积: {volume_needed:.2f} mL")
# 输出: 需要母液体积: 0.04 mL

（3）样品灭菌

  • 原则：确保样品无菌，避免污染。
  • 方法：
    • 过滤除菌：使用0.22 μm或0.45 μm滤膜过滤，适用于热不稳定物质（如抗生素、酶）。
    • 加热灭菌：适用于热稳定物质（如某些植物提取物），但需注意高温可能破坏活性成分。
    • 无菌操作：在超净台中进行所有操作，使用无菌容器和工具。

2. 载体的选择与处理

载体是承载抗菌物质并将其置于琼脂平板表面的工具。常见载体包括滤纸片、牛津杯、打孔法。

（1）滤纸片法

  • 载体：无菌滤纸片（直径通常6 mm或8 mm）。
  • 制备：
    1. 将滤纸片用打孔器或剪刀制成所需大小，置于无菌培养皿中。
    2. 高压蒸汽灭菌（121°C，15 min）或干热灭菌（160°C，2 h）。
    3. 也可购买商业化的无菌滤纸片。
  • 装载：用微量移液器将样品滴加到滤纸片上，通常每片10-20 μL。确保样品均匀浸润，避免溢出。

（2）牛津杯法

  • 载体：不锈钢或玻璃制成的牛津杯（内径通常6 mm，高10 mm）。
  • 制备：牛津杯需彻底清洗、灭菌（高压蒸汽或干热灭菌）。
  • 装载：将牛津杯置于琼脂平板表面，用微量移液器将样品注入杯内，直至满杯。样品通过杯底与琼脂接触扩散。

（3）打孔法

  • 载体：直接在琼脂平板上打孔（直径通常6-8 mm）。
  • 制备：用无菌打孔器或移液器吸头在琼脂上打孔，移除琼脂块。
  • 装载：将样品直接加入孔中，直至满孔。

（4）载体选择对比

载体类型 优点 缺点 适用场景
滤纸片法 操作简便、成本低、可批量处理 载体体积小、样品量有限、易受载体影响 常规筛选、教学实验
牛津杯法 样品量可控、扩散稳定、重复性好 需专用设备、操作稍复杂 定量分析、标准方法
打孔法 直接接触琼脂、扩散快 易污染、孔径不均影响结果 快速筛选、样品量大

3. 样品的装载

（1）滤纸片法装载步骤

  1. 准备：在超净台中，将无菌滤纸片平铺在无菌培养皿中。
  2. 加样：用微量移液器吸取样品，轻轻滴加在滤纸片中心，避免滴加过快导致样品飞溅。
  3. 浸润：让样品自然浸润滤纸片，通常等待1-2分钟。
  4. 转移：用无菌镊子将浸润后的滤纸片轻轻放置在已接种指示菌的琼脂平板表面，确保滤纸片与琼脂紧密接触，无气泡。
  5. 标记：用无菌记号笔在平板背面标记样品名称和位置。

（2）牛津杯法装载步骤

  1. 放置牛津杯：在超净台中，将无菌牛津杯轻轻按压在琼脂平板表面，确保杯底与琼脂紧密接触。
  2. 加样：用微量移液器将样品注入牛津杯，直至液面略高于杯口。
  3. 静置：静置10-15分钟，让样品通过杯底扩散到琼脂中。
  4. 标记：在平板背面标记样品名称。

（3）打孔法装载步骤

  1. 打孔：用无菌打孔器或移液器吸头在琼脂上打孔，用无菌镊子移除琼脂块。
  2. 加样：用微量移液器将样品加入孔中，直至满孔。
  3. 静置：静置10-15分钟，让样品扩散。
  4. 标记：在平板背面标记样品名称。

4. 对照的设置

对照是确保实验结果可靠性的关键。

（1）阳性对照

  • 目的：验证实验体系的有效性，确保指示菌对已知抗菌物质敏感。
  • 常用物质：标准抗生素（如青霉素、链霉素）或已知有效的消毒剂。
  • 示例：在测试植物提取物时，可设置青霉素（10 μg/mL）作为阳性对照。

（2）阴性对照

  • 目的：排除溶剂或载体本身对指示菌的影响。
  • 设置：
    • 溶剂对照：仅含溶剂（如无菌水、1% DMSO）的样品。
    • 载体对照：仅含载体（如无菌滤纸片、牛津杯）的样品。
  • 示例：若样品用1% DMSO溶解，阴性对照应为1% DMSO溶液。

（3）空白对照

  • 目的：验证琼脂平板本身无污染。
  • 设置：不接种指示菌的琼脂平板，或接种后不加任何样品的平板。

（4）对照设置示例 假设测试一种植物提取物（用1% DMSO溶解），可设置以下对照：

  • 阳性对照：青霉素（10 μg/mL，溶于无菌水）。
  • 阴性对照：1% DMSO溶液。
  • 空白对照：接种指示菌但不加任何样品的平板。

三、 实操步骤详解

1. 指示菌的准备

  • 菌种选择：根据实验目的选择指示菌，常见有：
    • 革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。
    • 革兰氏阴性菌：大肠杆菌（Escherichia coli）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。
    • 真菌：白色念珠菌（Candida albicans）。
  • 菌液制备：
    1. 将指示菌接种于适宜培养基（如LB肉汤），37°C振荡培养16-18小时。
    2. 用无菌生理盐水或PBS调整菌液浓度至0.5麦氏浊度（约1.5×10⁸ CFU/mL）。
    3. 可用比浊仪或分光光度计（OD600≈0.1）定量。

2. 琼脂平板的制备

  • 培养基选择：常用Mueller-Hinton琼脂（MHA），因其成分标准化，适合抗生素敏感性测试。也可根据指示菌选择其他培养基（如营养琼脂、马铃薯葡萄糖琼脂）。
  • 制备步骤：
    1. 称取MHA粉末，按说明书比例（通常38 g/L）加入蒸馏水，加热溶解。
    2. 高压蒸汽灭菌（121°C，15 min）。
    3. 冷却至约50°C（手感温热但不烫手），在超净台中倒入无菌培养皿（直径90 mm），每皿约15-20 mL，确保厚度均匀（约4 mm）。
    4. 静置凝固后，倒置培养皿，4°C保存备用（不超过2周）。

3. 接种与加样

  1. 接种：用无菌棉签蘸取调整好的菌液，均匀涂布于琼脂平板表面，确保菌液分布均匀。也可将菌液与琼脂混合后倒板（但此法较少用于抑菌圈实验）。
  2. 加样：在超净台中，将准备好的样品（滤纸片、牛津杯或打孔）放置于接种后的平板上。注意样品间距至少2 cm，避免抑菌圈重叠。
  3. 培养：将平板倒置，置于适宜温度（通常37°C）培养16-24小时。

4. 结果测量与分析

  • 测量：培养后，用游标卡尺或透明尺测量抑菌圈直径（包括滤纸片直径）。每个样品至少重复3次。
  • 分析：
    • 定性分析：比较抑菌圈大小，判断抗菌活性强弱。
    • 定量分析：根据标准曲线（抑菌圈直径 vs. 浓度对数）计算样品浓度。
  • 示例：青霉素标准曲线（滤纸片法，6 mm滤纸片，10 μL/片）：
    • 浓度（μg/mL）：0.5, 1, 2, 4, 8
    • 抑菌圈直径（mm）：8.5, 10.2, 12.1, 14.5, 16.8
    • 拟合线性方程：y = 2.5x + 7.0（y为直径，x为浓度对数）

四、 常见问题解析

1. 无抑菌圈或抑菌圈过小

  • 可能原因：
    • 样品无活性或浓度太低。
    • 溶剂选择不当，导致抗菌物质失活。
    • 指示菌不敏感或菌龄过老。
    • 琼脂厚度不均或pH值不适宜。
    • 培养时间过短。
  • 解决方案：
    • 提高样品浓度或更换溶剂。
    • 测试不同指示菌或使用新鲜菌液。
    • 优化培养基成分和厚度。
    • 延长培养时间至24-48小时。

2. 抑菌圈形状不规则或边缘模糊

  • 可能原因：
    • 样品加样不均匀（如滤纸片未浸润完全）。
    • 琼脂表面不平整或有气泡。
    • 指示菌涂布不均匀。
    • 样品扩散受阻（如琼脂过厚或过干）。
  • 解决方案：
    • 确保样品均匀浸润载体。
    • 平板制备时避免气泡，确保琼脂表面平整。
    • 涂布菌液时轻柔均匀。
    • 控制琼脂厚度（4-5 mm），避免平板过干。

3. 抑菌圈重叠或干扰

  • 可能原因：
    • 样品间距过小。
    • 样品扩散范围过大（如使用高浓度或易扩散物质）。
    • 平板倾斜导致样品流动。
  • 解决方案：
    • 增加样品间距（至少2 cm）。
    • 降低样品浓度或使用扩散系数较小的载体（如牛津杯）。
    • 确保平板水平放置。

4. 阴性对照出现抑菌圈

  • 可能原因：
    • 溶剂本身具有抗菌活性（如乙醇、DMSO浓度过高）。
    • 载体污染或未灭菌。
    • 琼脂或培养基污染。
  • 解决方案：
    • 降低溶剂浓度（如DMSO≤1% v/v）。
    • 确保载体和培养基无菌。
    • 重新制备培养基和载体。

5. 重复性差

  • 可能原因：
    • 菌液浓度不一致。
    • 样品制备误差（如浓度不准、加样体积不一致）。
    • 培养条件波动（温度、时间）。
    • 测量误差。
  • 解决方案：
    • 使用比浊仪或分光光度计精确调整菌液浓度。
    • 使用高精度微量移液器，定期校准。
    • 严格控制培养条件，使用恒温培养箱。
    • 由同一人测量，或使用图像分析软件（如ImageJ）自动测量。

五、 高级技巧与注意事项

1. 样品稳定性测试

  • 对于不稳定样品（如某些植物提取物），可测试不同储存条件（如4°C、-20°C）下的活性变化，确保实验期间样品稳定。

2. 多菌种测试

  • 同时测试多种指示菌（如革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌），以评估抗菌谱。

3. 与定量方法结合

  • 抑菌圈实验可与最小抑菌浓度（MIC）测定结合，通过稀释法（如肉汤稀释法）获得更精确的定量结果。

4. 安全与伦理

  • 处理病原菌时需在生物安全柜中操作，遵守实验室安全规范。
  • 使用抗生素时需注意耐药性问题，避免滥用。

六、 总结

抑菌圈实验的样品配置是一个系统工程，涉及抗菌物质的准备、载体的选择与处理、样品的装载以及对照的设置。通过理解原理、严格遵循实操步骤、及时排查常见问题，可以确保实验结果的准确性和可重复性。无论是科研还是教学，掌握这些细节都能显著提升实验效率和数据质量。希望本文的详细解析能为您的实验提供有力支持。