引言

抑菌实验是微生物学、药学、食品科学和环境科学等领域中不可或缺的实验技术。杯碟法（Cylinder-Plate Method）作为一种经典的定量抑菌实验方法，因其操作简便、结果可靠而被广泛应用于抗生素效价测定、抗菌物质筛选和抑菌活性评价。本文将深入解析杯碟法的原理，并详细阐述其操作步骤，帮助读者全面掌握这一关键技术。

一、杯碟法的基本原理

1.1 方法概述

杯碟法是一种基于扩散原理的抑菌实验方法。其核心思想是将待测样品（如抗生素溶液）置于含有指示菌的琼脂平板上，通过样品中活性成分在琼脂中的扩散形成抑菌圈（Zone of Inhibition），通过测量抑菌圈的直径来定量评价样品的抑菌活性。

1.2 扩散动力学基础

杯碟法的理论基础是菲克扩散定律（Fick’s Law of Diffusion）。当样品溶液中的活性成分从牛津杯（或滤纸片）向琼脂中扩散时，形成浓度梯度。在琼脂中，活性成分的浓度随距离的增加而降低，当浓度降至最低抑菌浓度（MIC）以下时，细菌开始生长，从而形成清晰的抑菌圈边界。

数学模型： 设活性成分的初始浓度为 ( C_0 )，扩散系数为 ( D )，时间 ( t ) 后，在距离扩散源 ( r ) 处的浓度 ( C(r,t) ) 可近似表示为： [ C(r,t) = \frac{C_0}{\sqrt{4\pi D t}} \exp\left(-\frac{r^2}{4Dt}\right) ] 当 ( C(r,t) = \text{MIC} ) 时，对应的 ( r ) 即为抑菌圈半径 ( R )。

1.3 抑菌圈形成的关键因素

  • 活性成分的扩散系数：分子量小、亲水性强的物质扩散更快，抑菌圈更大。
  • 琼脂浓度：琼脂浓度越高，扩散阻力越大，抑菌圈越小。
  • 菌液浓度：菌液浓度过高会抑制抑菌圈的形成，过低则抑菌圈边缘模糊。
  • 培养时间：培养时间不足，抑菌圈未完全形成；过长则可能导致抑菌圈扩散过度。

二、实验材料与设备

2.1 主要试剂

  • 培养基：常用营养琼脂（NA）、胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）或Mueller-Hinton琼脂（MHA）。
  • 指示菌：根据实验目的选择，如金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）等。
  • 待测样品：抗生素溶液、植物提取物、抗菌肽等。
  • 溶剂：无菌水、磷酸盐缓冲液（PBS）或有机溶剂（如DMSO）。
  • 牛津杯：不锈钢或玻璃材质，内径约6-8mm，高度约10mm。
  • 滤纸片：直径6mm的无菌滤纸片（用于滤纸片法）。

2.2 主要设备

  • 恒温培养箱：温度控制精度±0.5℃。
  • 高压灭菌锅：用于培养基和器具灭菌。
  • 无菌操作台：提供无菌环境。
  • 游标卡尺：精度0.02mm，用于测量抑菌圈直径。
  • 移液器：精确移取样品和菌液。
  • pH计：调节培养基pH值。

三、实验操作步骤详解

3.1 培养基制备

  1. 称量与溶解：按配方称取培养基干粉，加入蒸馏水，加热溶解。
  2. 调节pH：用1M NaOH或HCl调节pH至7.2-7.4（根据菌种需求）。
  3. 分装与灭菌：分装至锥形瓶，121℃高压灭菌15分钟。
  4. 冷却：灭菌后冷却至50-55℃（手感不烫手），备用。

示例代码（模拟培养基制备记录）：

# 培养基制备记录表（示例）
def prepare_medium():
    medium_info = {
        "medium_type": "Mueller-Hinton琼脂",
        "batch": "20231001",
        "weight": "38g/L",
        "pH": 7.3,
        "sterilization": "121℃, 15min",
        "cooling_temp": "52℃"
    }
    return medium_info

print(prepare_medium())

3.2 指示菌悬液制备

  1. 菌种活化：从斜面或冻存管中挑取菌种，划线接种于相应琼脂平板，37℃培养18-24小时。
  2. 菌落挑选：挑取单菌落接种于液体培养基（如LB肉汤），37℃振荡培养至对数生长期（OD600≈0.5）。
  3. 菌液浓度调整：用无菌生理盐水或PBS将菌液稀释至约10^6 CFU/mL（可通过比浊法或平板计数法校准）。

示例代码（菌液浓度计算）：

# 菌液稀释计算
def calculate_dilution(initial_conc, target_conc, volume):
    """
    计算稀释比例
    initial_conc: 初始浓度 (CFU/mL)
    target_conc: 目标浓度 (CFU/mL)
    volume: 最终体积 (mL)
    """
    dilution_factor = initial_conc / target_conc
    initial_volume = volume / dilution_factor
    diluent_volume = volume - initial_volume
    return {
        "dilution_factor": dilution_factor,
        "initial_volume": f"{initial_volume:.2f} mL",
        "diluent_volume": f"{diluent_volume:.2f} mL"
    }

# 示例：从10^8 CFU/mL稀释到10^6 CFU/mL，最终体积100mL
result = calculate_dilution(1e8, 1e6, 100)
print(result)

3.3 平板制备

  1. 倒平板：将冷却至50-55℃的琼脂倒入无菌培养皿（直径90mm），每皿约15-20mL，确保厚度均匀。
  2. 添加菌液：待琼脂凝固后，取100μL菌液均匀涂布于平板表面，或直接将菌液与琼脂混合（倾注法）。
  3. 凝固：室温放置10-15分钟使琼脂完全凝固。

注意事项：

  • 平板厚度应一致，否则影响扩散。
  • 菌液涂布需均匀，避免局部菌浓度过高。

3.4 样品准备

  1. 溶解：将待测样品溶解于适当溶剂中，确保完全溶解且无沉淀。
  2. 浓度梯度：设置系列浓度梯度（如0.1, 0.5, 1, 5, 10 mg/mL），每个浓度至少3个重复。
  3. 对照设置：
    • 阳性对照：已知效价的标准抗生素（如青霉素、链霉素）。
    • 阴性对照：溶剂（如PBS或DMSO）。
    • 空白对照：无样品，仅溶剂。

示例代码（浓度梯度设计）：

# 浓度梯度设计
def concentration_gradient(base_conc, dilution_factor, steps):
    """
    base_conc: 基础浓度 (mg/mL)
    dilution_factor: 稀释因子
    steps: 稀释步数
    """
    gradients = [base_conc]
    for i in range(steps):
        next_conc = base_conc / (dilution_factor ** (i+1))
        gradients.append(next_conc)
    return gradients

# 示例：从10 mg/mL开始，2倍稀释5次
gradients = concentration_gradient(10, 2, 5)
print(f"浓度梯度 (mg/mL): {gradients}")

3.5 加样与培养

  1. 放置牛津杯：在凝固的琼脂平板上，用无菌镊子放置牛津杯（或滤纸片），轻轻按压确保与琼脂接触良好。
  2. 加样：用移液器将样品溶液加入牛津杯中，通常加满（约100-200μL）。
  3. 预扩散：将平板在4℃冰箱中预扩散30-60分钟，使样品充分扩散。
  4. 培养：将平板倒置（防止冷凝水滴落）于恒温培养箱中，37℃培养18-24小时。

示例代码（实验记录表）：

# 实验记录表
def experiment_record(plate_id, sample, concentration, replicates):
    record = {
        "plate_id": plate_id,
        "sample": sample,
        "concentration": f"{concentration} mg/mL",
        "replicates": replicates,
        "incubation": "37℃, 24h",
        "notes": "牛津杯法，预扩散45min"
    }
    return record

# 示例记录
record = experiment_record("P20231001-1", "Plant Extract A", 5.0, 3)
print(record)

3.6 结果测量与分析

  1. 测量抑菌圈：用游标卡尺测量抑菌圈直径（mm），从不同方向测量至少两次取平均值。
  2. 数据处理：
    • 计算每个浓度的平均抑菌圈直径和标准差。
    • 绘制浓度-抑菌圈直径标准曲线（通常为线性或对数线性关系）。
    • 通过标准曲线计算样品的效价或MIC。
  3. 统计分析：使用t检验或ANOVA分析不同浓度间的差异显著性。

示例代码（数据处理与绘图）：

import numpy as np
import matplotlib.pyplot as plt
from scipy import stats

# 示例数据：浓度(mg/mL) vs 抑菌圈直径(mm)
concentrations = np.array([0.1, 0.5, 1.0, 5.0, 10.0])
diameters = np.array([8.2, 10.5, 12.8, 15.2, 18.5])  # 平均值

# 线性回归
slope, intercept, r_value, p_value, std_err = stats.linregress(
    np.log10(concentrations), diameters
)

# 绘制标准曲线
plt.figure(figsize=(8, 6))
plt.scatter(np.log10(concentrations), diameters, color='blue', label='实验数据')
plt.plot(np.log10(concentrations), 
         slope * np.log10(concentrations) + intercept, 
         'r-', label=f'拟合线 (R²={r_value**2:.3f})')
plt.xlabel('log10(浓度 mg/mL)')
plt.ylabel('抑菌圈直径 (mm)')
plt.title('浓度-抑菌圈直径标准曲线')
plt.legend()
plt.grid(True)
plt.show()

# 计算未知样品的浓度（假设抑菌圈直径为14.0mm）
def calculate_concentration(diameter, slope, intercept):
    log_conc = (diameter - intercept) / slope
    concentration = 10 ** log_conc
    return concentration

unknown_diameter = 14.0
unknown_conc = calculate_concentration(unknown_diameter, slope, intercept)
print(f"未知样品浓度: {unknown_conc:.2f} mg/mL")

四、常见问题与解决方案

4.1 抑菌圈不清晰或边缘模糊

  • 原因：菌液浓度过高或过低；琼脂厚度不均；培养时间不足。
  • 解决方案：
    • 校准菌液浓度至10^6 CFU/mL。
    • 确保琼脂厚度一致（约4mm）。
    • 延长培养时间至24小时。

4.2 抑菌圈过小或过大

  • 原因：样品浓度过低或过高；琼脂浓度不合适；扩散条件不佳。
  • 解决方案：
    • 调整样品浓度梯度。
    • 优化琼脂浓度（通常1.5-2.0%）。
    • 确保预扩散时间充足（30-60分钟）。

4.3 重复性差

  • 原因：操作不一致；环境温度波动；平板质量差异。
  • 解决方案：
    • 严格遵循操作规程，使用同一批次培养基。
    • 控制实验室温度稳定。
    • 增加重复次数（至少3次）。

4.4 假阳性或假阴性

  • 原因：溶剂干扰（如DMSO浓度过高）；样品中杂质影响；指示菌不敏感。
  • 解决方案：
    • 设置溶剂对照，确保溶剂浓度不影响菌生长。
    • 纯化样品，去除干扰物质。
    • 更换指示菌或使用标准菌株。

五、应用实例

5.1 抗生素效价测定

实验设计：

  • 样品：未知浓度的青霉素溶液。
  • 标准品：已知效价的青霉素标准品（1000 IU/mg）。
  • 指示菌：金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）。
  • 方法：牛津杯法，浓度梯度为0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 8.0 IU/mL。

结果分析：

  • 标准品的抑菌圈直径与浓度呈线性关系（R² > 0.99）。
  • 未知样品的抑菌圈直径对应标准曲线，计算出效价为850 IU/mg。

5.2 植物提取物抑菌活性评价

实验设计：

  • 样品：绿茶提取物（EGCG含量50%）。
  • 溶剂：DMSO（终浓度%）。
  • 指示菌：大肠杆菌（ATCC 25922）和金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）。
  • 方法：滤纸片法，浓度梯度为0.1, 0.5, 1.0, 5.0 mg/mL。

结果分析：

  • 对金黄色葡萄球菌的MIC为0.5 mg/mL，对大肠杆菌的MIC为1.0 mg/mL。
  • 抑菌圈直径与浓度呈对数线性关系。

六、注意事项与优化建议

6.1 实验安全

  • 所有操作应在无菌条件下进行，防止污染。
  • 使用抗生素或有毒物质时，佩戴手套和护目镜。
  • 废弃物按生物安全规范处理。

6.2 方法优化

  • 琼脂浓度：根据样品性质调整，亲水性物质可适当降低琼脂浓度（1.2-1.5%）。
  • 预扩散时间：对于扩散慢的物质（如大分子），可延长至2小时。
  • 培养温度：根据指示菌需求调整，如嗜冷菌可在15-20℃培养。

6.3 质量控制

  • 阳性对照：每次实验必须包含已知效价的标准品，以验证实验系统有效性。
  • 阴性对照：确保溶剂无抑菌活性。
  • 重复性：每个浓度至少3个重复，计算标准差和变异系数（CV<10%）。

七、结论

杯碟法作为一种经典、可靠的抑菌实验方法，在抗菌研究和应用中具有重要价值。通过深入理解其原理并严格遵循操作步骤，可以获得准确、可重复的实验结果。在实际应用中，应根据样品特性和实验目的进行适当优化，并结合其他方法（如微量稀释法）进行验证。随着技术的发展，自动化杯碟法系统和图像分析软件的应用将进一步提高实验效率和准确性。

八、参考文献（示例）

  1. 中国药典委员会. (2020). 中华人民共和国药典（四部）. 中国医药科技出版社.
  2. CLSI. (2023). Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests. M100.
  3. Balouiri, M., Sadiki, M., & Ibnsouda, S. K. (2016). Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis, 6(2), 71-79.
  4. 陈代杰, 李继安. (2018). 抗菌药物研发与应用. 科学出版社.

注：本文提供的代码示例为模拟数据，实际实验中需根据具体条件调整参数。所有操作应遵循实验室安全规范和相关标准操作程序（SOP）。