抑菌实验是微生物学、药学、食品科学和环境科学等领域中评估物质（如抗生素、植物提取物、消毒剂等）抑制微生物生长能力的重要方法。准确、规范的接种操作是实验成功的关键，直接影响结果的可靠性和可重复性。本文将详细阐述抑菌实验的接种操作流程、关键步骤、常见问题及其解决方案，旨在为实验人员提供一份清晰、实用的指导。

一、 实验前准备

充分的准备工作是确保实验顺利进行的基础，包括材料、试剂、仪器和环境的准备。

1.1 材料与试剂准备

  • 菌种：根据实验目的选择标准菌株（如大肠杆菌 E. coli ATCC 25922、金黄色葡萄球菌 S. aureus ATCC 25923）或待测环境/临床分离株。确保菌种活化良好，处于对数生长期（通常培养18-24小时）。
  • 培养基：常用营养琼脂（NA）或胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）作为基础培养基。对于特定菌种，可能需要选择性培养基。
  • 待测样品：如抗生素溶液、植物提取物、消毒剂等。需提前配制好不同浓度的溶液，并设置合适的溶剂对照（如无菌水、DMSO、乙醇等）。
  • 无菌耗材：无菌培养皿、无菌移液枪头、无菌涂布棒（玻璃或塑料）、无菌镊子、无菌打孔器（用于牛津杯法）等。
  • 其他试剂：无菌生理盐水或PBS（用于菌悬液制备）、75%酒精、无菌棉签等。

1.2 仪器设备准备

  • 培养箱：根据菌种需求设定温度（通常37℃）。
  • 超净工作台：确保工作台面清洁，使用前紫外照射30分钟，并开启风机。
  • 高压蒸汽灭菌锅：用于培养基和耗材的灭菌。
  • 电子天平、pH计、移液器：确保精度和准确性。
  • 涡旋振荡器：用于混匀菌悬液。
  • 恒温水浴锅：用于融化培养基。

1.3 环境准备

  • 超净工作台：操作前用75%酒精擦拭台面和内壁，确保无菌环境。
  • 个人防护：穿戴实验服、手套、口罩，必要时佩戴护目镜。

二、 标准抑菌实验接种操作流程（以纸片扩散法/琼脂扩散法为例）

纸片扩散法（Kirby-Bauer法）是最常用的定性/半定量抑菌实验方法。以下为详细操作步骤。

2.1 菌悬液制备

  1. 菌种活化：从斜面或冻存管中挑取单菌落，接种于液体培养基（如LB肉汤），37℃摇床培养18-24小时。
  2. 菌液浓度调整：取适量菌液，用无菌生理盐水或PBS进行系列稀释。通常通过比浊法（如使用0.5麦氏标准比浊管）或分光光度计（OD600≈0.1）调整菌液浓度至约1.5×10⁸ CFU/mL（相当于0.5麦氏浊度）。这是关键步骤，浓度直接影响抑菌圈大小。
    • 示例：将培养18小时的大肠杆菌菌液用无菌生理盐水稀释，直至在比色管中与0.5麦氏标准管的浊度一致。此时菌液浓度约为1.5×10⁸ CFU/mL。

2.2 培养基制备与倒板

  1. 融化培养基：将配制好的营养琼脂培养基（约20-25 mL/皿）在高压灭菌后，置于恒温水浴锅中融化（约45-50℃），避免过热杀死菌种。
  2. 倒板：在超净台中，将融化的培养基倒入无菌培养皿中，每皿约15-20 mL。轻轻晃动使培养基均匀铺满皿底，静置凝固。注意：培养基厚度应均匀，避免倾斜或气泡。
  3. 干燥：将凝固的平板在超净台中开盖倒置放置约30分钟，或置于37℃培养箱中干燥15-20分钟，使表面略干，便于后续涂布。

2.3 接种（涂布法）

  1. 取菌：用无菌移液枪吸取0.1 mL（或0.5 mL）调整好浓度的菌悬液，滴加到已干燥的琼脂平板中央。
  2. 涂布：立即用无菌涂布棒（玻璃棒或塑料棒）将菌液均匀涂布于整个平板表面。涂布时动作要轻柔、快速，避免划破琼脂表面。涂布后，将平板静置5-10分钟，使菌液被琼脂吸收。
  3. 放置药敏纸片（此步骤在涂布后进行）：
    • 用无菌镊子夹取药敏纸片（含特定浓度抗生素），轻轻贴在涂布好的琼脂表面。
    • 关键点：纸片间距应大于24 mm（通常30 mm），纸片中心距平板边缘不小于15 mm。确保纸片与琼脂表面完全接触，无气泡。
    • 示例：在直径为90 mm的平板上，可放置4-6个纸片，呈对称分布。

2.4 培养与观察

  1. 培养：将平板倒置（防止冷凝水滴落影响结果），放入37℃培养箱中培养16-18小时。
  2. 测量：培养结束后，取出平板，用游标卡尺或专用测量尺测量抑菌圈直径（包括纸片直径）。抑菌圈为无菌生长区域。
  3. 结果判读：根据CLSI（临床和实验室标准化协会）标准或相关文献，将测量结果与标准值比较，判断菌株的敏感性（敏感、中介、耐药）。

三、 其他常见接种方法

3.1 牛津杯法（打孔法）

  • 操作：在倒好的琼脂平板上，用无菌打孔器打孔（直径约6-8 mm），孔内加入待测样品（如抗生素溶液、植物提取物）。然后在平板表面均匀涂布一层菌悬液（浓度同上）。培养后测量抑菌圈直径。
  • 优点：适用于液体样品，可定量。
  • 注意：打孔要垂直，避免孔壁破裂；加样量要准确（通常20-50 μL）。

3.2 液体稀释法（MIC测定）

  • 操作：在96孔板中，用液体培养基进行系列稀释。加入待测样品和菌悬液（通常每孔100 μL培养基+50 μL样品+50 μL菌液，最终菌浓度约5×10⁵ CFU/mL）。培养后通过肉眼观察或仪器检测（如OD值）判断最小抑菌浓度（MIC）。
  • 关键：无菌操作要求极高，需设置阴性对照（培养基+样品，无菌）和阳性对照（培养基+菌液，无样品）。

四、 常见问题解析与解决方案

问题1：抑菌圈不规则、边缘模糊

  • 可能原因：
    1. 菌悬液浓度不均匀或未充分混匀。
    2. 涂布不均匀，导致菌落生长密度不一致。
    3. 培养基表面不平整或有气泡。
    4. 培养时间过长，菌落蔓延。
  • 解决方案：
    • 确保菌悬液在涡旋振荡器上充分混匀。
    • 涂布时动作轻柔、均匀，可练习提高涂布技巧。
    • 倒板时避免晃动，确保培养基凝固平整。
    • 严格控制培养时间，根据菌种生长速度调整（通常16-24小时）。

问题2：无抑菌圈或抑菌圈过小

  • 可能原因：
    1. 菌悬液浓度过高，菌落生长过密，抑制了抑菌圈的形成。
    2. 待测样品浓度太低或无效。
    3. 样品扩散性差（如粘稠样品）。
    4. 药敏纸片失效（过期或保存不当）。
    5. 培养时间不足。
  • 解决方案：
    • 精确调整菌液浓度：使用0.5麦氏标准比浊管或分光光度计校准。
    • 设置浓度梯度：对未知样品，应设置多个浓度梯度进行测试。
    • 改善样品扩散：对于粘稠样品，可适当稀释或使用牛津杯法。
    • 检查纸片：确保纸片在有效期内，-20℃密封保存。
    • 延长培养时间：但需注意菌落过度生长。

问题3：抑菌圈内出现菌落生长（“卫星菌落”）

  • 可能原因：
    1. 菌悬液中存在耐药突变株。
    2. 样品中抑菌成分扩散不均匀，局部浓度不足。
    3. 培养时间过长。
  • 解决方案：
    • 使用纯化菌株，避免污染。
    • 确保样品与培养基充分混合（对于液体样品）。
    • 适当缩短培养时间。

问题4：对照组出现异常

  • 阴性对照（无菌对照）：应无菌生长。若有菌落，说明操作过程污染。
    • 解决方案：加强无菌操作，检查超净台、培养基灭菌效果。
  • 阳性对照（菌液对照）：应均匀生长。若生长不良，说明菌液浓度低或培养基问题。
    • 解决方案：重新制备菌液，检查培养基成分和pH。

问题5：样品自身颜色干扰观察

  • 可能原因：样品（如植物提取物、染料）本身有颜色，影响抑菌圈观察。
  • 解决方案：
    • 设置空白对照：在相同培养基中加入等量样品，观察颜色是否干扰。
    • 使用牛津杯法：样品在孔内，颜色扩散范围小，易于观察。
    • 拍照后图像分析：使用图像处理软件（如ImageJ）分析抑菌圈。

五、 实验优化与注意事项

  1. 无菌操作：始终是微生物实验的第一原则。任何步骤的污染都可能导致实验失败。
  2. 平行实验：所有实验组和对照组应至少设置3个平行，以减少偶然误差。
  3. 记录：详细记录实验条件，包括菌种、菌液浓度、培养基、培养温度和时间、样品浓度等，便于结果复现和问题追溯。
  4. 安全：处理致病菌时，必须在生物安全柜中操作，并遵循生物安全规范。废液和废弃物需高压灭菌后处理。
  5. 方法验证：对于新样品或新菌种，建议先进行预实验，确定合适的浓度范围和培养条件。

六、 总结

抑菌实验的接种操作看似简单，但细节决定成败。从菌液浓度的精确调整、培养基的均匀倒板，到涂布的均匀性和纸片的规范放置，每一步都需要严谨和耐心。通过理解常见问题的根源并采取相应的解决方案，可以显著提高实验的成功率和数据的可靠性。希望本指南能为您的抑菌实验提供有力的支持，助您获得准确、可重复的实验结果。