抑菌实验是微生物学、药学、食品科学和环境科学等领域中至关重要的研究方法，用于评估化合物、天然提取物或商业产品对细菌生长的抑制能力。一个严谨的实验流程是获得可靠、可重复结果的关键。本指南将详细解析从样品准备到结果判定的全流程，并提供具体的示例和注意事项。

一、 实验前准备与样品制备

1.1 实验设计与方案制定

在开始任何实验之前，必须明确实验目的和设计。

  • 明确测试对象：你要测试的是什么？是单一化合物（如抗生素）、植物提取物、消毒剂还是食品防腐剂？
  • 选择测试菌株：根据研究目的选择合适的菌株。常见标准菌株包括：
    • 革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，如ATCC 25923）
    • 革兰氏阴性菌：大肠杆菌（Escherichia coli，如ATCC 25922）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，如ATCC 27853）
    • 其他：根据需要选择，如枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、沙门氏菌（Salmonella）等。
  • 确定实验方法：常用方法包括纸片扩散法（Kirby-Bauer法）、微量肉汤稀释法（MIC测定）、琼脂打孔法等。本文将以最常用的纸片扩散法和微量肉汤稀释法为例进行详细说明。
  • 设置对照组：
    • 阳性对照：使用已知有效的抗菌剂（如标准抗生素纸片），验证实验体系的有效性。
    • 阴性对照：使用不含抗菌成分的溶剂（如无菌水、DMSO），排除溶剂本身的影响。
    • 空白对照：仅含培养基和菌液，用于观察菌落正常生长情况。

1.2 样品制备

样品的制备方式直接影响实验结果的准确性。

  • 样品类型：
    • 液体样品：如消毒剂、提取液。需用无菌溶剂（如PBS、生理盐水）进行系列稀释。
    • 固体样品：如粉末、植物组织。需先用适当溶剂（如乙醇、甲醇、水）进行提取，获得提取液。
    • 不溶性样品：如纳米材料、某些聚合物。可能需要分散在琼脂中或使用特殊方法。
  • 溶剂选择：溶剂必须无菌，且对测试菌株无抑制作用。常用溶剂包括：
    • 无菌蒸馏水
    • 磷酸盐缓冲液（PBS）
    • 二甲基亚砜（DMSO）：常用于溶解难溶性化合物，但需注意其浓度（通常不超过1% v/v），高浓度DMSO本身有抑菌作用。
    • 乙醇：同样需控制浓度。
  • 浓度梯度设置：为了确定最小抑菌浓度（MIC），通常需要设置一系列浓度梯度。例如，对于一个初始浓度为100 mg/mL的样品，可以设置梯度：100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.5625 mg/mL。
    • 示例：制备植物提取物的浓度梯度。
      1. 制备母液：称取100 mg干燥的植物提取物，溶解于1 mL无菌DMSO中，得到100 mg/mL的母液。
      2. 系列稀释：在无菌EP管中，用无菌PBS进行倍比稀释。
        • 管1：100 mg/mL (母液)
        • 管2：取500 μL母液 + 500 μL PBS → 50 mg/mL
        • 管3：取500 μL管2液 + 500 μL PBS → 25 mg/mL
        • …以此类推，直到所需最低浓度。
      3. 注意：每个浓度点应设置至少3个平行重复。

1.3 培养基与试剂准备

  • 培养基：
    • 营养肉汤（NB）：用于细菌的液体培养和增菌。
    • 营养琼脂（NA）或胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）：用于固体培养基制备。
    • Mueller-Hinton琼脂（MHA）：是纸片扩散法的标准培养基，因其成分标准化，能提供良好的重现性。
  • 试剂：
    • 无菌生理盐水或PBS：用于菌液稀释。
    • 无菌棉签：用于涂布菌液。
    • 无菌镊子：用于放置药敏纸片。
    • 药敏纸片：如果测试已知抗生素，需购买标准纸片。对于未知样品，需自制纸片（见下文）。
    • 无菌培养皿（直径90 mm）。
  • 设备：
    • 恒温培养箱（通常37°C）
    • 生物安全柜（用于无菌操作）
    • 涡旋振荡器
    • 移液器及无菌枪头
    • 高压灭菌锅
    • pH计

二、 菌种活化与菌液制备

2.1 菌种活化

从菌种保藏管（如甘油管）或斜面中挑取少量菌落，划线接种于新鲜的营养琼脂平板上，于37°C培养18-24小时，获得单个菌落。这一步确保菌株处于对数生长期，活性高。

2.2 菌液制备（标准化）

这是实验成功的关键步骤之一，需要确保菌液浓度标准化。

  1. 挑取单菌落：用无菌接种环从活化平板上挑取3-5个形态相似的单菌落，接种于5-10 mL无菌营养肉汤中。
  2. 培养：37°C，150-200 rpm振荡培养约4-6小时，直至菌液达到对数生长期中期（OD600 ≈ 0.5-0.8，具体值需根据菌株和仪器校准）。
  3. 稀释：用无菌生理盐水或PBS将菌液稀释至约1.5 × 10^8 CFU/mL（相当于0.5麦氏浊度标准）。这是纸片扩散法的标准浓度。
    • 麦氏浊度标准：可以使用商业化的0.5麦氏比浊管，或通过OD600值换算（通常大肠杆菌OD600=0.1约等于10^8 CFU/mL，需自行校准）。
    • 示例：测得菌液OD600为0.6，已知该菌株在OD600=0.1时浓度为1×10^8 CFU/mL，则当前浓度为6×10^8 CFU/mL。需用无菌生理盐水稀释6倍，得到1×10^8 CFU/mL的菌液。注意：纸片扩散法要求菌液浓度为1.5×10^8 CFU/mL，因此需将OD600=0.6的菌液稀释4倍（6×10^8 / 1.5×10^8 = 4）。
  4. 验证：可取100 μL稀释后的菌液涂布于琼脂平板，37°C培养过夜，计数菌落数以验证浓度（应为100-300 CFU/平板）。

三、 实验操作流程（以纸片扩散法为例）

纸片扩散法（Kirby-Bauer法）是临床和科研中最常用的定性/半定量方法，用于测定抑菌圈直径。

3.1 制备含菌琼脂平板

  1. 将Mueller-Hinton琼脂（MHA）融化并冷却至约45-50°C（手感温热但不烫手）。
  2. 在生物安全柜中，将20 mL（或根据平板大小调整）冷却的MHA倒入无菌培养皿中，轻轻晃动使琼脂均匀铺满底部。
  3. 静置凝固：在水平台面上静置至少15-30分钟，使琼脂完全凝固。确保平板水平，否则抑菌圈会不规则。
  4. 涂布菌液：
    • 用无菌棉签蘸取稀释好的菌液（1.5×10^8 CFU/mL）。
    • 在琼脂表面均匀涂布，确保覆盖整个表面。通常涂布3次，每次旋转平板60度，最后沿平板边缘绕一圈。
    • 关键：涂布要均匀，不能有液滴残留。涂布后静置5-10分钟，让菌液被琼脂吸收。

3.2 放置药敏纸片

  1. 自制纸片：对于未知样品（如植物提取物），需自制纸片。
    • 材料：无菌滤纸片（直径6 mm，厚度1 mm）。
    • 浸渍：将滤纸片浸入待测样品溶液中（如不同浓度的提取物），浸泡约10-15分钟。
    • 干燥：在无菌条件下，将浸渍后的纸片置于无菌滤纸上，室温干燥（或用吹风机冷风辅助）。
    • 注意：确保纸片完全干燥，否则会扩散不均。
  2. 放置纸片：
    • 用无菌镊子夹取纸片（或标准抗生素纸片）。
    • 将纸片轻轻按压在涂布好菌液的琼脂表面，确保纸片与琼脂完全接触，无气泡。
    • 布局：一个平板通常可放置4-6个纸片，纸片中心间距至少24 mm，纸片边缘距平板边缘至少15 mm。切勿用手直接接触纸片。
  3. 倒置培养：将平板倒置（防止冷凝水滴落），放入37°C恒温培养箱中培养16-18小时（通常过夜）。

3.3 结果测量与判定

  1. 测量抑菌圈：培养结束后，取出平板，用游标卡尺或透明尺子测量抑菌圈直径（包括纸片直径）。测量时，从抑菌圈边缘到边缘，取最大和最小直径的平均值。
  2. 结果解释：
    • 抑菌圈直径 > 7 mm：通常认为有抑菌活性。
    • 参照标准：对于抗生素，有临床和实验室标准（如CLSI M100标准）可参考。对于未知样品，通常以抑菌圈直径 ≥ 8 mm作为有活性的初步判断标准，但需结合MIC值进一步确认。
    • 示例：测试某植物提取物对大肠杆菌的抑制作用。
      • 平板1：放置浸渍了100 mg/mL提取物的纸片，抑菌圈直径为18 mm。
      • 平板2：放置浸渍了50 mg/mL提取物的纸片，抑菌圈直径为12 mm。
      • 平板3：放置浸渍了25 mg/mL提取物的纸片，抑菌圈直径为8 mm。
      • 平板4：放置浸渍了12.5 mg/mL提取物的纸片，抑菌圈直径为6 mm（无活性）。
      • 结论：该提取物对大肠杆菌有抑菌活性，其最小有效浓度（MEC）在25-50 mg/mL之间。

四、 实验操作流程（以微量肉汤稀释法测定MIC为例）

微量肉汤稀释法是测定最小抑菌浓度（MIC）的金标准方法，提供定量数据。

4.1 96孔板布局设计

  1. 准备96孔板：使用无菌的96孔聚苯乙烯板（平底或圆底均可，平底更利于观察）。
  2. 布局示例：
    • A1-A12：样品浓度梯度（如100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.5625, 0.78125 mg/mL，每个浓度设3个重复）。
    • B1-B3：阳性对照（已知抗生素，如氨苄青霉素，浓度梯度）。
    • B4-B6：阴性对照（溶剂对照，如1% DMSO）。
    • B7-B9：空白对照（仅培养基，无菌液）。
    • B10-B12：生长对照（仅培养基+菌液，无样品）。
    • C1-C12：重复A行的样品浓度梯度。
    • D1-D12：重复A行的样品浓度梯度。
    • E行及以下：可测试其他菌株或其他样品。

4.2 加样步骤（以测试一个样品为例）

  1. 配制样品工作液：将样品母液用无菌肉汤（如MHB）稀释至所需最高浓度（如100 mg/mL）。
  2. 系列稀释：
    • 在96孔板的A1-A12孔中，每孔加入100 μL无菌MHB。
    • 在A1孔中加入100 μL样品工作液（100 mg/mL），混匀。
    • 从A1孔中取出100 μL，加入到A2孔中，混匀。
    • 从A2孔中取出100 μL，加入到A3孔中，混匀。
    • …以此类推，进行倍比稀释，直至A12孔。最后从A12孔中吸出100 μL丢弃。
    • 结果：A1-A12孔的浓度依次为：100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.5625, 0.78125, 0.390625, 0.1953125, 0.09765625, 0.048828125 mg/mL。
  3. 加入菌液：
    • 将稀释好的菌液（1.5×10^8 CFU/mL）用MHB稀释100倍，得到约1.5×10^6 CFU/mL的菌液。
    • 在A1-A12孔（样品孔）和B10-B12孔（生长对照）中，每孔加入100 μL稀释后的菌液。
    • 注意：此时，样品孔的最终体积为200 μL，样品浓度被稀释了一倍（如A1孔最终浓度为50 mg/mL）。因此，加样时需预先考虑稀释倍数。更常见的做法是：先在孔中加入50 μL样品溶液，再加入50 μL菌液，最后加入100 μL MHB，使总体积为200 μL，且样品浓度不变。
    • 标准加样法：
      1. 在96孔板中，每孔加入50 μL MHB。
      2. 在样品浓度梯度孔（如A1-A12）中，每孔加入50 μL样品溶液（浓度已预先配制好，如100 mg/mL）。
      3. 在所有含菌孔（样品孔和生长对照）中，每孔加入50 μL稀释好的菌液（1.5×10^6 CFU/mL）。
      4. 此时，样品孔总体积为150 μL，样品浓度被稀释了1.5倍。因此，配制样品溶液时，浓度应为目标浓度的1.5倍。例如，若想测试最终浓度为100 mg/mL，则配制的样品溶液浓度应为150 mg/mL。
  4. 设置对照：
    • 阳性对照：加入已知抗生素（如氨苄青霉素）的梯度浓度。
    • 阴性对照：加入等体积的溶剂（如1% DMSO）和菌液。
    • 空白对照：仅加入MHB和菌液。
    • 生长对照：仅加入MHB和菌液，无样品。
  5. 培养：用封板膜密封96孔板，置于37°C恒温培养箱中培养16-20小时。

4.3 结果读取与判定

  1. 读取结果：
    • 肉眼观察：培养后，观察孔内液体的浑浊度。与生长对照孔（应浑浊）和空白对照孔（应澄清）对比。
    • 仪器读取：使用酶标仪在600 nm波长下读取各孔的OD值。通常，OD值与生长对照孔相比，降低50%以上，或与空白对照孔接近，即认为有抑制作用。
  2. 确定MIC：
    • MIC定义：在肉眼观察下，能完全抑制细菌生长的最低浓度。即，从最高浓度开始，第一个澄清的孔对应的浓度就是MIC。
    • 示例：测试某化合物对金黄色葡萄球菌的MIC。
      • 孔浓度：100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.5625, 0.78125 mg/mL
      • 结果：100-12.5 mg/mL孔澄清（无生长），6.25 mg/mL及以下孔浑浊（有生长）。
      • 结论：该化合物的MIC为12.5 mg/mL。
  3. 最小杀菌浓度（MBC）测定（可选）：
    • 从MIC孔及高于MIC的澄清孔中，取100 μL菌液，涂布于无菌琼脂平板上。
    • 37°C培养24小时，观察菌落生长情况。
    • MBC定义：能杀死99.9%初始菌量的最低浓度。通常，MBC是MIC的1-4倍。

五、 结果分析与报告

5.1 数据整理

  • 纸片扩散法：记录抑菌圈直径（mm），计算平均值和标准差。
  • 微量肉汤稀释法：记录MIC值（mg/mL），通常报告为范围（如12.5-25 mg/mL）或具体值（如12.5 mg/mL）。

5.2 统计分析

  • 使用统计软件（如SPSS, GraphPad Prism）进行数据分析。
  • 比较不同浓度样品间的抑菌圈直径差异（如ANOVA分析）。
  • 比较不同菌株间的MIC差异。

5.3 报告撰写

一份完整的报告应包括：

  1. 材料与方法：详细描述样品、菌株、培养基、实验步骤、对照设置。
  2. 结果：
    • 以表格或图表形式展示数据（如抑菌圈直径表、MIC值表）。
    • 附上典型平板照片（纸片扩散法）或96孔板照片（肉汤稀释法）。
  3. 讨论：
    • 解释结果的意义，与文献报道进行比较。
    • 分析可能的影响因素（如样品纯度、溶剂效应、菌株敏感性）。
    • 提出局限性和未来研究方向。
  4. 结论：简明扼要地总结主要发现。

六、 常见问题与解决方案

  1. 抑菌圈不规则或呈星状：
    • 原因：琼脂不平、菌液涂布不均、纸片未完全接触琼脂、培养箱内气流不均。
    • 解决：确保平板水平放置，均匀涂布菌液，轻轻按压纸片，使用高质量的培养箱。
  2. 无抑菌圈或抑菌圈过小：
    • 原因：样品无活性、样品浓度太低、菌液浓度太高、培养时间过长、纸片吸液不足。
    • 解决：提高样品浓度，验证菌液浓度，确保纸片充分浸渍。
  3. 96孔板中出现“跳孔”现象（即本应澄清的孔浑浊）：
    • 原因：加样时交叉污染、封板膜不严导致蒸发、菌液污染。
    • 解决：严格无菌操作，使用高质量封板膜，确保每一步操作准确。
  4. 溶剂对照有抑菌作用：
    • 原因：溶剂浓度过高（如DMSO > 1% v/v）。
    • 解决：降低溶剂浓度，或更换其他溶剂（如PBS、水）。

七、 安全与伦理注意事项

  1. 生物安全：所有操作应在生物安全柜中进行，处理后的菌液和废弃物需经高压灭菌（121°C，15-20分钟）后才能丢弃。
  2. 化学品安全：处理化学品（如DMSO、有机溶剂）时，需佩戴手套、护目镜，避免皮肤接触和吸入。
  3. 数据真实性：确保实验记录完整、准确，不伪造或篡改数据。

通过遵循以上详细的步骤和注意事项，您可以系统地进行抑菌实验，获得可靠、可重复的结果，为后续研究或应用提供坚实的数据支持。