引言

临床微生物检验是现代医学诊断体系中不可或缺的一环，它直接关系到感染性疾病的精准诊断和抗生素的合理使用。作为一名检验人员，从掌握基础理论到熟练进行实战操作，再到攻克鉴定难点和把控质控要点，每一步都至关重要。本指南旨在为您提供一份全面的笔记，帮助您在日常工作中提升诊断准确率，确保患者安全。

第一部分：基础理论篇

1.1 细菌的基本结构与功能

细菌是临床微生物检验中最常见的病原体。了解其基本结构是鉴定的基础。

  • 细胞壁：主要由肽聚糖构成，是革兰氏染色区分的基础。革兰氏阳性菌肽聚糖层厚，革兰氏阴性菌则薄，且有外膜。
  • 细胞膜：负责物质交换和能量代谢。
  • 细胞质：包含核糖体、质粒等重要结构。
  • 核区：细菌的遗传物质，无核膜包裹。

1.2 革兰氏染色原理与步骤

革兰氏染色是微生物检验中最基础也是最重要的技术之一。

  1. 涂片：取菌液涂布于载玻片上，干燥固定。
  2. 初染：滴加结晶紫染液，染色1分钟，水洗。
  3. 媒染：滴加碘液，染色1分钟，水洗。
  4. 脱色：用95%乙醇脱色，约30秒，水洗。这是关键步骤，脱色过度会导致假阴性，不足则假阳性。
  5. 复染：滴加稀释复红或沙黄，染色30秒，水洗，干燥后镜检。

结果：革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。

1.3 细菌的生长条件与代谢

细菌的生长需要适宜的营养、温度、pH和气体环境。临床常见细菌多为嗜温菌，最适温度35-37℃。

  • 培养基：按用途分为基础培养基、增菌培养基、选择培养基和鉴别培养基。例如，血琼脂平板是常用的营养丰富的培养基。
  • 代谢产物：细菌分解糖、蛋白质产生的酸、酶、气体等是鉴定的重要依据。例如，IMViC试验（吲哚、甲基红、VP、枸橼酸盐）常用于大肠埃希菌和产气肠杆菌的鉴别。

第二部分：实战操作篇

2.1 标本采集与处理

标本质量直接影响检验结果。常见标本包括血液、尿液、痰液、脓液等。

  • 血液培养：严格无菌操作，采血量成人5-10ml，儿童1-5ml。注入血培养瓶后立即送检。
  • 尿液培养：清洁中段尿，避免污染。尿量不少于1ml。
  • 痰液：晨痰为佳，涂片镜检白细胞与上皮细胞比例>2.5为合格标本。

处理流程：

  1. 核对信息，登记。
  2. 观察标本性状（颜色、气味、粘稠度）。
  3. 直接涂片镜检（如痰液革兰氏染色）。
  4. 根据标本类型和临床提示选择合适的培养基和接种方法。

2.2 分离培养与纯化

  • 分区划线法：在平板上分区划线，目的是获得单个菌落。操作时要灼烧接种环，冷却后划线。
  • 孵育：根据细菌需求选择需氧、厌氧或CO2环境，一般培养18-24小时观察。

纯化：挑取单个菌落进行转种，确保获得纯培养，以便进行后续的生化和药敏试验。

2.3 药敏试验（AST）

药敏试验是指导临床用药的关键。常用方法为纸片扩散法（Kirby-Bauer法）和最低抑菌浓度（MIC）测定。

纸片扩散法步骤：

  1. 调整菌液浊度至0.5麦氏标准。
  2. 用无菌棉拭子蘸取菌液，均匀涂布于MH琼脂平板（需氧菌）。
  3. 用无菌镊子将药敏纸片均匀贴于平板表面，纸片间距不小于24mm。
  4. 35℃孵育16-18小时，测量抑菌圈直径。

结果判读：根据CLSI（临床和实验室标准化协会）标准，判读为敏感（S）、中介（I）或耐药（R）。

第三部分：常见致病菌鉴定难点解析

3.1 葡萄球菌属的鉴定与区分

难点：凝固酶阴性葡萄球菌（CoNS）与金黄色葡萄球菌的区分，以及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的快速检测。

解决方案：

  • 凝固酶试验：是区分金黄色葡萄球菌（阳性）与表皮葡萄球菌（阴性）的关键。但需注意，有些菌株可能表现不稳定。
  • MRSA检测：
    • 纸片法：使用头孢西丁或苯唑西林纸片。金黄色葡萄球菌对头孢西丁抑菌圈≤21mm即报告MRSA。
    • PCR法：快速检测mecA基因，是金标准。

实例：某患者伤口分泌物培养出凝固酶阴性葡萄球菌，但临床感染症状明显。此时不能轻易判定为污染，需结合药敏结果。若该菌对多种抗生素耐药，特别是对苯唑西林耐药，则可能为致病菌，需报告MRSCN（耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌）。

3.2 大肠埃希菌与志贺菌的鉴别

难点：两者生化反应相似，均发酵乳糖，IMViC结果均为++–（大肠埃希菌典型），但志贺菌不发酵乳糖（宋内志贺菌除外，且发酵缓慢）。

解决方案：

  • 关键鉴别点：动力。大肠埃希菌有鞭毛，动力阳性；志贺菌无鞭毛，动力阴性。
  • 血清学鉴定：对于疑似志贺菌，需用特异性血清进行凝集试验。

实例：在SS平板上，大肠埃希菌呈粉红色菌落（发酵乳糖），志贺菌为无色透明菌落（不发酵乳糖）。若菌落无色，IMViC++–，动力阴性，则高度怀疑志贺菌。

3.3 铜绿假单胞菌的鉴定

难点：产生多种色素（绿脓素、荧光素），有时色素不典型，且与其他假单胞菌生化反应有重叠。

解决方案：

  • 特征性色素：绿脓素（蓝绿色）和荧光素（绿色荧光）是重要线索。
  • 氧化酶试验：阳性。
  • 关键生化：42℃能生长（多数假单胞菌不能），硝酸盐还原产气，乙酰胺利用阳性。

实例：一株分离自烧伤患者创面的细菌，产生绿色色素，氧化酶阳性，42℃生长，不发酵乳糖，鉴定为铜绿假单胞菌。若色素不明显，需依赖生化管或质谱仪进一步确认。

第四部分：质量控制要点

质量控制是检验结果准确性的生命线。

4.1 室内质控（IQC）

  • 培养基质控：每批新购培养基需用标准菌株（如大肠埃希菌ATCC 25922、金黄色葡萄球菌ATCC 25923、铜绿假单胞菌ATCC 27853）进行生长试验和生化反应验证。
    • 示例：血琼脂平板上，金黄色葡萄球菌ATCC 25923应生长良好，β-溶血；MH琼脂上，大肠埃希菌ATCC 25922对氨苄西林的抑菌圈应在规定范围内。
  • 试剂质控：氧化酶试剂、触酶试剂等每日使用前需用阳性、阴性菌株验证。
  • 仪器质控：自动化鉴定仪和药敏系统需每日、每周、每月进行校准和质控菌株测试。

4.2 室间质评（EQA）

参加国家或省级临检中心的室间质评活动，了解自身实验室水平，发现系统误差。

4.3 人员与操作规范

  • 人员培训：定期培训，考核上岗。
  • SOP文件：所有操作必须严格按照标准操作规程（SOP）执行，避免人为误差。
  • 记录完整：所有质控数据必须记录、分析，发现问题及时纠正。

第五部分：提升诊断准确率的综合策略

5.1 加强与临床沟通

  • 了解病史：主动询问患者症状、用药史、感染部位，有助于判断是定植还是感染，选择正确的培养条件。
  • 解读报告：对于特殊耐药机制（如ESBL、CRE、VRE）及时与临床医生沟通，指导用药。

5.2 利用新技术

  • 质谱技术（MALDI-TOF MS）：快速、准确鉴定细菌，缩短报告时间。
  • 分子诊断：如PCR、GeneXpert等，用于快速检测特定病原体（如结核分枝杆菌、艰难梭菌）和耐药基因。

5.3 持续学习与总结

  • 阅读文献：关注最新病原体流行趋势和耐药机制。
  • 案例讨论：定期组织科室内部案例讨论，分析疑难病例，积累经验。

结语

临床微生物检验是一项严谨而细致的工作，需要扎实的理论基础、熟练的操作技能、严谨的质控意识和持续的学习精神。通过本指南的学习，希望您能更好地应对工作中的挑战，准确鉴定病原菌，为临床提供可靠的诊断依据，最终造福患者。