抑菌环实验（也称为纸片扩散法或Kirby-Bauer法）是微生物学中用于评估抗菌药物敏感性的经典方法。该实验通过测量抗菌药物在琼脂平板上扩散形成的抑菌环直径，来判断细菌对抗菌药物的敏感程度。规范执行抑菌环实验对于获得准确可靠的结果至关重要，因为任何操作偏差都可能导致错误的药敏结果，进而影响临床治疗决策。本文将详细介绍抑菌环实验的规范操作步骤、常见错误及其避免方法，并提供确保结果准确可靠的实用建议。
一、实验原理与目的
抑菌环实验基于抗菌药物在琼脂中的扩散原理。将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板表面，药物从纸片向周围琼脂扩散，形成浓度梯度。在药物浓度高于最低抑菌浓度（MIC）的区域，细菌生长被抑制，形成透明的抑菌环。抑菌环直径与药物的MIC呈负相关，即抑菌环越大，细菌对该药物越敏感。
实验目的：
- 评估细菌对特定抗菌药物的敏感性（敏感、中介或耐药）。
- 为临床选择抗菌药物提供依据。
- 监测细菌耐药性的变化趋势。
二、实验材料与设备
1. 主要材料
- 测试菌株：临床分离的细菌（如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等），需纯培养。
- 抗菌药物纸片：商业化的标准化纸片（如头孢曲松、阿莫西林等），储存于-20°C或4°C干燥环境。
- 培养基：Mueller-Hinton琼脂（MHA），pH 7.2-7.4，厚度4mm。
- 生理盐水：0.85% NaCl，用于制备菌悬液。
- 质控菌株：标准菌株（如大肠杆菌ATCC 25922、金黄色葡萄球菌ATCC 25923）。
2. 主要设备
- 恒温培养箱（35±2°C）
- 涡旋振荡器
- 比浊仪或麦氏比浊管
- 无菌棉签或涂布棒
- 无菌镊子或纸片分配器
- 游标卡尺（精度0.1mm）
- 生物安全柜
三、规范操作步骤
步骤1：菌悬液制备
- 从纯培养平板上挑取3-5个菌落，放入无菌生理盐水中。
- 涡旋振荡15-20秒，使菌落均匀分散。
- 调整菌悬液浊度至0.5麦氏单位（约1.5×10⁸ CFU/mL），可通过比浊仪或麦氏比浊管测定。
- 麦氏比浊管法：将菌悬液与0.5麦氏标准管比较，调整至浊度一致。
- 比浊仪法：使用比浊仪测定，确保OD₆₀₀在0.08-0.10之间。
示例：制备金黄色葡萄球菌ATCC 25923的菌悬液。挑取3个菌落至5mL生理盐水中，涡旋振荡后，用比浊仪测定OD₆₀₀为0.09，符合0.5麦氏单位标准。
步骤2：琼脂平板接种
- 取无菌棉签蘸取菌悬液，在试管壁上轻轻挤压以去除多余液体。
- 用棉签均匀涂布整个Mueller-Hinton琼脂平板表面，旋转平板60°，重复涂布3次，确保菌液均匀分布。
- 静置5-10分钟，使菌液完全吸收。
关键点：涂布均匀性直接影响抑菌环的对称性。避免过度涂布导致菌液过多，形成过厚的菌苔。
步骤3：纸片贴放
- 使用无菌镊子或纸片分配器，将抗菌药物纸片轻轻贴在琼脂表面，确保纸片与琼脂完全接触。
- 纸片间距至少24mm，纸片与平板边缘距离至少15mm，避免纸片重叠。
- 贴放后轻压纸片，确保粘附牢固。
示例：在直径90mm的平板上，可贴放6-8个纸片。例如，贴放头孢曲松、阿莫西林、庆大霉素等纸片，每个纸片中心间距25mm，距离平板边缘18mm。
步骤4：培养与观察
- 将平板倒置（防止冷凝水滴落）放入35±2°C培养箱中。
- 培养16-18小时（一般细菌）或24小时（生长缓慢的细菌）。
- 培养后，取出平板，观察抑菌环。
步骤5：抑菌环直径测量
- 使用游标卡尺测量抑菌环直径，包括纸片直径。
- 测量时，将卡尺对准抑菌环的边缘，从不同角度测量2-3次，取平均值。
- 注意：抑菌环边缘应清晰，若有模糊或双环现象，需重新实验。
示例：测量头孢曲松纸片的抑菌环。纸片直径为6mm，抑菌环直径为22mm，实际抑菌环直径为22mm（通常直接报告总直径，但需参考标准表）。
步骤6：结果判读
- 参照CLSI（临床实验室标准化协会）或EUCAST（欧洲抗菌药物敏感性试验委员会）标准，将测量值与临界值比较。
- 判读结果为敏感（S）、中介（I）或耐药（R）。
示例：对于大肠杆菌和头孢曲松，CLSI标准：抑菌环直径≥21mm为敏感，18-20mm为中介，≤17mm为耐药。若测得抑菌环直径为22mm，则判读为敏感。
四、常见错误及避免方法
错误1：菌悬液浊度不准确
- 问题：菌悬液过浓或过稀，导致抑菌环直径偏小或偏大。
- 避免方法：
- 严格使用比浊仪或麦氏比浊管，确保浊度为0.5麦氏单位。
- 定期校准比浊仪，使用标准菌株验证。
- 避免使用陈旧菌落或污染菌落。
错误2：琼脂平板厚度不均
- 问题：琼脂厚度不均导致药物扩散不均匀，抑菌环不对称。
- 避免方法：
- 使用商业化的Mueller-Hinton琼脂，确保厚度一致（4mm）。
- 倾注琼脂时，平板应水平放置，冷却后检查厚度。
- 避免使用自制琼脂，除非严格控制成分和厚度。
错误3：纸片贴放不当
- 问题：纸片未完全接触琼脂或间距过小，导致抑菌环重叠或变形。
- 避免方法：
- 使用无菌镊子轻轻放置纸片，避免用手直接接触。
- 使用纸片分配器确保间距一致。
- 贴放后轻压纸片，确保粘附。
错误4：培养条件不当
- 问题：温度过高或过低、培养时间不足或过长，影响细菌生长和药物扩散。
- 避免方法：
- 严格控制培养箱温度在35±2°C。
- 培养时间一般为16-18小时，避免超过24小时。
- 培养时平板倒置，防止冷凝水干扰。
错误5：测量误差
- 问题：测量时未对准抑菌环边缘，或使用精度不足的工具。
- 避免方法：
- 使用游标卡尺（精度0.1mm）测量。
- 从不同角度测量2-3次，取平均值。
- 在良好光线下观察，避免视觉误差。
错误6：未使用质控菌株
- 问题：未进行质控，无法判断实验系统是否正常。
- 避免方法：
- 每次实验同时使用标准质控菌株（如大肠杆菌ATCC 25922）。
- 质控结果应在允许范围内（如头孢曲松对大肠杆菌的抑菌环直径应为21-27mm）。
- 若质控失败，需检查实验步骤并重新实验。
五、确保结果准确可靠的实用建议
1. 严格遵循标准操作程序（SOP）
- 制定详细的SOP，包括每一步的操作细节、质控要求和记录表格。
- 定期培训实验人员，确保操作一致性。
2. 使用标准化的材料和设备
- 选择商业化的Mueller-Hinton琼脂和抗菌药物纸片，避免批次差异。
- 定期校准比浊仪、培养箱和游标卡尺。
3. 实施全面的质控
- 每日质控：使用标准菌株验证实验系统。
- 批次质控：每批新琼脂或纸片使用前进行验证。
- 人员质控：定期进行人员间比对实验。
4. 详细记录实验数据
- 记录菌株信息、纸片批次、培养条件、测量值和质控结果。
- 建立电子数据库，便于追溯和分析。
5. 定期审核和改进
- 定期审核实验数据，识别常见错误和趋势。
- 根据审核结果改进操作流程。
六、实例分析：金黄色葡萄球菌对苯唑西林的敏感性测试
实验设计
- 测试菌株：临床分离的金黄色葡萄球菌。
- 质控菌株：金黄色葡萄球菌ATCC 25923。
- 抗菌药物纸片：苯唑西林（1μg/片）。
- 培养基：Mueller-Hinton琼脂，厚度4mm。
- 培养条件：35±2°C，18小时。
操作步骤
- 制备菌悬液：挑取3个菌落至5mL生理盐水中，涡旋振荡，比浊仪测定OD₆₀₀为0.09。
- 接种：用棉签均匀涂布琼脂平板，静置10分钟。
- 贴放纸片：使用镊子贴放苯唑西林纸片，确保与琼脂接触。
- 培养：倒置平板，35°C培养18小时。
- 测量：用游标卡尺测量抑菌环直径，测得为14mm。
- 判读：参照CLSI标准，苯唑西林对金黄色葡萄球菌的临界值为≥13mm为敏感，≤12mm为耐药。14mm判读为敏感。
质控验证
- 质控菌株金黄色葡萄球菌ATCC 25923对苯唑西林的抑菌环直径应为17-21mm。本次实验测得18mm，在允许范围内，表明实验系统正常。
常见错误分析
- 若测得抑菌环直径为10mm，可能原因包括：
- 菌悬液过浓（浊度>0.5麦氏单位），导致细菌生长过密，抑菌环变小。
- 纸片贴放不牢，药物扩散不充分。
- 培养时间过长（>24小时），细菌可能产生耐药性。
- 解决方案：重新制备菌悬液，确保浊度准确；检查纸片贴放；严格控制培养时间。
七、总结
抑菌环实验是评估细菌药物敏感性的关键方法，其结果的准确性直接影响临床治疗决策。通过规范操作步骤、避免常见错误并实施全面质控，可以确保实验结果的可靠性和准确性。实验人员应严格遵循标准操作程序，使用标准化材料和设备，并定期进行质控和审核。只有这样，抑菌环实验才能为临床提供有价值的药敏信息，助力抗菌药物的合理使用。
关键要点回顾：
- 菌悬液浊度必须准确（0.5麦氏单位）。
- 琼脂平板厚度均匀（4mm）。
- 纸片贴放规范，间距足够。
- 培养条件严格控制（35±2°C，16-18小时）。
- 使用游标卡尺精确测量。
- 每次实验必须包括质控菌株。
通过遵循这些指南，您可以最大限度地减少实验误差，获得准确可靠的抑菌环实验结果。