一、引言

抑菌率实验是微生物学、药学、食品科学和环境科学等领域中评估物质（如抗生素、消毒剂、植物提取物、纳米材料等）抗菌活性的核心方法。该实验通过量化待测物对特定微生物生长的抑制程度，为产品研发、质量控制和科学研究提供关键数据。一个完整的抑菌率实验流程包括：实验设计、样品准备、微生物培养、抑菌圈测定（或最小抑菌浓度测定）、数据记录与计算、结果分析与解读。本文将详细拆解每个步骤，并提供具体操作示例和注意事项，确保实验的准确性和可重复性。

二、实验设计阶段

2.1 明确实验目的与待测物

  • 目的：是评估单一物质的抑菌效果，还是比较不同配方的差异？是用于产品开发还是学术研究？
  • 待测物：明确其物理化学性质（如水溶性、稳定性、挥发性）。例如，测试一种新型植物精油（如茶树精油）的抑菌效果，需考虑其易挥发性，实验需在密闭或快速操作的条件下进行。

2.2 选择实验方法

根据待测物和微生物特性选择合适的方法：

  • 琼脂扩散法（如纸片法、牛津杯法）：适用于水溶性或可扩散的样品，直观显示抑菌圈。
  • 微量稀释法（如肉汤稀释法）：用于测定最小抑菌浓度（MIC） 和最小杀菌浓度（MBC），更精确，但操作更复杂。
  • 时间-杀菌曲线：评估杀菌动力学，适用于消毒剂或需要快速作用的物质。

示例：若测试一种新型抗菌肽（水溶性好），可先采用琼脂扩散法快速筛选，再用微量稀释法测定MIC。

2.3 确定测试微生物

  • 标准菌株：通常使用ATCC（美国模式培养物集存库）标准菌株，如金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC 25923）、大肠杆菌（Escherichia coli ATCC 25922）。
  • 临床或环境分离株：若研究特定场景（如医院感染），需使用临床分离的耐药菌株。
  • 对照菌株：设置阳性对照（已知有效抗生素，如氨苄青霉素）和阴性对照（无菌水或溶剂）。

2.4 设计实验组与对照组

  • 实验组：不同浓度的待测物（如0.1 mg/mL, 0.5 mg/mL, 1.0 mg/mL）。
  • 阳性对照：已知有效抗菌剂（如10 μg/mL氨苄青霉素纸片）。
  • 阴性对照：溶剂（如无菌水、DMSO）。
  • 空白对照：不加任何物质的培养基，用于确认培养基无菌。

示例设计：

组别 处理 目的
实验组1 0.1 mg/mL 植物精油 评估低浓度效果
实验组2 0.5 mg/mL 植物精油 评估中浓度效果
实验组3 1.0 mg/mL 植物精油 评估高浓度效果
阳性对照 10 μg/mL 氨苄青霉素 验证实验系统有效性
阴性对照 无菌水 排除溶剂影响
空白对照 无 确认培养基无菌

2.5 确定重复次数与统计方法

  • 重复次数：每个浓度至少3次生物学重复（不同培养批次）和3次技术重复（同一批次内平行操作）。
  • 统计方法：使用t检验、ANOVA（方差分析）或非参数检验比较组间差异。例如，使用GraphPad Prism进行单因素方差分析（One-way ANOVA）并进行Tukey事后检验。

三、实验准备与样品制备

3.1 培养基与试剂准备

  • 培养基：根据微生物需求选择。细菌常用LB肉汤（液体）或LB琼脂（固体）；真菌常用PDA（马铃薯葡萄糖琼脂）。
  • 试剂：无菌水、溶剂（如DMSO、乙醇）、PBS缓冲液等。
  • 灭菌：所有培养基和试剂需121°C高压灭菌15分钟，或使用0.22 μm滤膜过滤除菌。

3.2 待测物制备

  • 溶解：根据溶解性选择溶剂。例如，植物精油不溶于水，可用少量乙醇或DMSO溶解，再用无菌水稀释至所需浓度。
  • 浓度梯度：准备系列浓度。例如，将精油原液（100 mg/mL）用无菌水稀释至0.1, 0.5, 1.0 mg/mL。
  • 无菌操作：所有操作在超净台中进行，使用无菌移液器和容器。

示例：植物精油样品制备

  1. 取10 μL纯精油（密度约0.9 g/mL，约9 mg）溶于1 mL无菌乙醇中，得到9 mg/mL母液。
  2. 用无菌水稀释母液：取100 μL母液 + 900 μL无菌水 → 0.9 mg/mL工作液。
  3. 进一步稀释：取100 μL 0.9 mg/mL工作液 + 900 μL无菌水 → 0.09 mg/mL（近似0.1 mg/mL）。

3.3 微生物培养

  • 复苏：从-80°C甘油管中划线接种到LB琼脂平板，37°C培养18-24小时。
  • 制备菌悬液：挑取单菌落接种于5 mL LB肉汤，37°C摇床培养至对数期（OD600 ≈ 0.5-0.8）。
  • 标准化：用无菌PBS调整菌液浓度至10^8 CFU/mL（约0.1 OD600），或使用麦氏比浊管校准。

示例：金黄色葡萄球菌菌悬液制备

  1. 从-80°C甘油管划线LB琼脂平板，37°C培养18小时。
  2. 挑取单菌落接种于5 mL LB肉汤，37°C 200 rpm摇床培养4小时至OD600 ≈ 0.6。
  3. 取1 mL菌液，用无菌PBS稀释10倍，测OD600 ≈ 0.06（对应约10^8 CFU/mL）。
  4. 若OD600不准确，可用平板计数法校准：取100 μL稀释菌液涂布LB琼脂，37°C培养24小时，计数菌落。

四、抑菌圈测定（琼脂扩散法）

4.1 平板制备

  • 底层琼脂：在无菌培养皿中倒入15-20 mL无菌琼脂培养基（如LB琼脂），水平放置凝固。
  • 菌层琼脂：将冷却至45-50°C的琼脂与标准化菌悬液混合（通常100 mL琼脂 + 1 mL菌液），立即倒入底层琼脂上，厚度约4 mm，凝固后备用。

注意：菌层琼脂需均匀，避免气泡。若测试真菌，需使用PDA培养基，且菌层需更厚（约5 mm）以防止菌丝过度生长。

4.2 加样

  • 纸片法：将无菌滤纸片（直径6 mm）浸入待测物溶液，沥干后贴于菌层琼脂表面。每个浓度至少3个重复。
  • 牛津杯法：将无菌牛津杯（内径6 mm）置于菌层琼脂上，加入待测物溶液至满杯。
  • 对照：同时贴阳性对照纸片（如氨苄青霉素）和阴性对照纸片（溶剂）。

示例操作：

  1. 取无菌滤纸片（6 mm）浸入0.5 mg/mL植物精油溶液10秒，沥干后贴于菌层琼脂。
  2. 用无菌镊子将纸片均匀放置，间距至少2 cm。
  3. 轻轻按压确保接触，倒置平板于37°C培养18-24小时。

4.3 培养与观察

  • 培养条件：根据微生物需求设置温度和时间。细菌37°C 18-24小时；真菌28°C 48-72小时。
  • 观察：培养后，用游标卡尺测量抑菌圈直径（包括纸片直径）。抑菌圈清晰、边缘整齐为有效。

示例数据记录：

浓度 (mg/mL) 抑菌圈直径 (mm) 重复1 重复2 重复3 平均值 ± SD
0.1 8.2 7.9 8.5 8.2 8.2 ± 0.3
0.5 12.5 12.0 13.0 12.5 12.5 ± 0.5
1.0 16.8 16.5 17.0 16.8 16.8 ± 0.25
阳性对照 20.0 19.5 20.5 20.0 20.0 ± 0.5
阴性对照 6.0 6.0 6.0 6.0 6.0 ± 0.0

五、微量稀释法测定MIC和MBC

5.1 实验设置

  • 96孔板：使用无菌96孔板，每行设置不同浓度待测物。
  • 浓度梯度：通常设置2倍系列稀释。例如，从1 mg/mL开始，稀释至0.001 mg/mL。
  • 对照：阳性对照（已知抗生素）、阴性对照（溶剂）、空白对照（无菌培养基）。

示例：96孔板布局（测试植物精油对金黄色葡萄球菌的MIC）

  • 行A：1 mg/mL（20 μL精油溶液 + 180 μL菌液）
  • 行B：0.5 mg/mL（从A行取100 μL + 100 μL菌液）
  • 行C：0.25 mg/mL（从B行取100 μL + 100 μL菌液）
  • 行D：0.125 mg/mL（从C行取100 μL + 100 μL菌液）
  • 行E：0.0625 mg/mL（从D行取100 μL + 100 μL菌液）
  • 行F：0.03125 mg/mL（从E行取100 μL + 100 μL菌液）
  • 行G：阳性对照（氨苄青霉素，10 μg/mL）
  • 行H：阴性对照（溶剂，如0.1% DMSO）

5.2 操作步骤

  1. 加样：在96孔板中，每孔加入100 μL无菌LB肉汤。
  2. 加待测物：在A行各孔加入100 μL待测物溶液（如1 mg/mL），混匀后取100 μL至B行，依次稀释。
  3. 加菌液：每孔加入100 μL标准化菌悬液（10^6 CFU/mL，最终浓度约10^5 CFU/mL）。
  4. 培养：37°C摇床培养18-24小时（或静置培养）。
  5. 读数：观察孔内浑浊度。无浑浊（澄清）表示无菌生长，即为抑菌终点。

5.3 MIC和MBC测定

  • MIC：肉眼观察无浑浊的最低浓度。例如，若0.125 mg/mL孔澄清，0.25 mg/mL及以上浑浊，则MIC = 0.125 mg/mL。
  • MBC：从MIC及更高浓度的澄清孔中取100 μL，涂布LB琼脂平板，37°C培养24小时。无菌落生长的最低浓度为MBC。

示例数据：

浓度 (mg/mL) 浑浊度（18小时） 浑浊度（24小时） MIC判定
1.0 澄清 澄清
0.5 澄清 澄清
0.25 澄清 澄清
0.125 澄清 澄清 MIC
0.0625 浑浊 浑浊
0.03125 浑浊 浑浊
阳性对照 澄清 澄清
阴性对照 浑浊 浑浊

MBC测定：从0.125, 0.25, 0.5, 1.0 mg/mL孔取样涂布，若0.125 mg/mL孔涂布后无菌落，则MBC = 0.125 mg/mL；若有菌落，则需测试更高浓度。

六、数据记录与计算

6.1 抑菌率计算（针对琼脂扩散法）

抑菌率通常不直接计算，而是通过抑菌圈直径反映。但若需量化，可使用以下公式：

  • 相对抑菌率（与阳性对照比较）： [ \text{相对抑菌率} (\%) = \frac{\text{实验组抑菌圈直径} - \text{阴性对照直径}}{\text{阳性对照直径} - \text{阴性对照直径}} \times 100 ] 示例：实验组直径12.5 mm，阴性对照6.0 mm，阳性对照20.0 mm。 [ \text{相对抑菌率} = \frac{12.5 - 6.0}{20.0 - 6.0} \times 100 = \frac{6.5}{14.0} \times 100 = 46.4\% ]

6.2 MIC和MBC数据记录

  • MIC：直接记录浓度值（如0.125 mg/mL）。
  • MBC：记录浓度值（如0.25 mg/mL）。
  • MBC/MIC比值：通常≤4表示杀菌剂，>4表示抑菌剂。例如，若MIC=0.125 mg/mL，MBC=0.5 mg/mL，则MBC/MIC=4，可能为杀菌剂。

6.3 统计分析

  • 数据整理：使用Excel或统计软件整理数据。
  • 显著性检验：例如，比较不同浓度抑菌圈直径的差异，使用单因素方差分析（ANOVA）。
  • 图表绘制：使用GraphPad Prism或Origin绘制浓度-抑菌圈直径曲线，或MIC分布图。

示例：绘制浓度-抑菌圈直径曲线

  1. 输入数据：浓度（X轴）和平均抑菌圈直径（Y轴）。
  2. 拟合曲线：可选择线性或非线性拟合（如四参数逻辑曲线）。
  3. 计算EC50（半数有效浓度）：即50%最大抑菌效果时的浓度。

七、结果分析与解读

7.1 抑菌圈法结果解读

  • 抑菌圈直径：直径越大，抑菌活性越强。需与阳性对照比较，评估相对效力。
  • 浓度-效应关系：通常呈正相关，但高浓度可能因扩散限制或毒性导致平台期。
  • 异常情况：
    • 无抑菌圈：待测物不溶于水、不扩散，或浓度太低。
    • 抑菌圈不规则：菌层不均匀或待测物挥发。
    • 抑菌圈内有菌落：可能是耐药菌或待测物不稳定。

示例解读：

  • 植物精油在0.5 mg/mL时抑菌圈直径12.5 mm，约为阳性对照的62.5%，表明中等活性。
  • 随浓度增加，抑菌圈直径增大，符合剂量依赖性。

7.2 MIC/MBC结果解读

  • MIC值：越低表示抗菌活性越强。例如，MIC=0.125 mg/mL的精油比MIC=1 mg/mL的活性强8倍。
  • MBC/MIC比值：比值≤4通常表示杀菌作用，>4表示抑菌作用。例如，MBC/MIC=4，表明该精油可能具有杀菌潜力。
  • 与标准比较：与已知抗生素比较，评估其相对效力。例如，该精油MIC=0.125 mg/mL，而氨苄青霉素MIC=0.001 mg/mL，表明精油活性较弱。

7.3 综合分析与讨论

  • 活性评价：结合抑菌圈、MIC和MBC数据，全面评估待测物的抗菌谱和效力。
  • 机制推测：结合文献，推测作用机制（如破坏细胞膜、抑制蛋白质合成）。
  • 应用潜力：根据活性和安全性，评估在食品防腐、医疗器械涂层或化妆品中的应用前景。
  • 局限性：体外实验不能完全模拟体内环境，需进一步动物实验验证。

示例讨论： “本研究中，植物精油对金黄色葡萄球菌的MIC为0.125 mg/mL，MBC为0.25 mg/mL，MBC/MIC=2，表明其具有杀菌作用。抑菌圈实验显示浓度依赖性，0.5 mg/mL时抑菌圈直径12.5 mm，约为阳性对照的62.5%。与文献报道的茶树精油（MIC约0.25 mg/mL）相比，本研究的精油活性更强，可能与其特定成分（如萜品烯-4-醇）含量较高有关。然而，体外实验结果需在动物模型中进一步验证，且需评估其对哺乳动物细胞的毒性。”

八、常见问题与解决方案

8.1 无抑菌圈或MIC过高

  • 原因：待测物不溶于水、浓度太低、微生物耐药、培养条件不当。
  • 解决方案：优化溶剂（如使用DMSO助溶）、提高浓度、更换测试菌株、调整培养时间。

8.2 抑菌圈不规则或模糊

  • 原因：菌层不均匀、待测物挥发、纸片未贴平。
  • 解决方案：确保琼脂冷却至45-50°C再倒板，快速操作，使用密封胶带固定纸片。

8.3 阳性对照失效

  • 原因：抗生素失效、菌液浓度太高、培养条件错误。
  • 解决方案：检查抗生素有效期，重新校准菌液浓度，验证培养箱温度。

8.4 数据波动大

  • 原因：操作不一致、菌液浓度不均、培养条件波动。
  • 解决方案：严格标准化操作，使用同一菌液批次，控制培养环境（温度、湿度）。

九、结论

抑菌率实验是评估抗菌活性的基础方法，从实验设计到数据解读需严谨细致。通过合理设计实验组、标准化操作、准确记录数据和科学分析，可获得可靠的结果。本文详细介绍了琼脂扩散法和微量稀释法的操作流程、数据计算和结果解读，并提供了常见问题的解决方案。掌握这些技能，将有助于在科研和工业应用中有效评估抗菌物质的性能。

十、参考文献（示例）

  1. CLSI. (2023). Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 33rd ed. Clinical and Laboratory Standards Institute.
  2. Balouiri, M., Sadiki, M., & Ibnsouda, S. K. (2016). Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis, 6(2), 71-79.
  3. Sarker, S. D., Nahar, L., & Kumarasamy, Y. (2007). Microtitre plate-based antibacterial assay incorporating resazurin as an indicator of cell growth, and its application in the in vitro antibacterial screening of phytochemicals. Methods, 42(4), 321-324.

（注：以上内容为示例性指南，实际实验需根据具体待测物和微生物特性调整，并遵守实验室安全规范。）